Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma
Summary
Grip virüsleri konak hücre kromatin ile birlikte kendi RNA genomu çoğaltmak. Burada, enfekte olmuş hücrelerin kromatin gelen sağlam virüs ribonükleoprotein kompleksleri arındırmak için bir yöntem sunulmaktadır. Viral kompleksleri Arıtılmış sırasıyla, Western blot ve protein ve RNA içerikleri astar uzantısı hem de analiz edilebilir.
Abstract
Tüm negatif dallı RNA virüsleri gibi, influenza virüs genomu tek zincirli genom nükleoprotein (NP) tarafından kapsül içine, ve oluşan trimeric polimeraz kompleksi ile ilişkili olduğu viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNP), formunda paketlenmiş PA, PB1 ve PB2 alt birimlerinin. Bununla birlikte, çoğu RNA virüslerinin aksine, influenza virüs enfekte olmuş hücreler, çekirdeklerinde viral RNA'nın sentezi gerçekleştirmek. İlginçtir, viral mRNA sentezi primer olarak hücresel öncesi mRNA'ların kullanır ve bu süreç kromatin 1 gerçekleşir ileri sürülmektedir. Viral polimeraz ve konak RNA polimeraz II yanı sıra, NP ve ev sahibi arasındaki nükleozom arasındaki etkileşimlerin da 1,2 karakterize edilmiştir.
Yakın zamanda, bir tek Strep-Tag kodlayan rekombinant influenza virüsünün üretimi genetik olarak viral polimeraz PB2 alt biriminin C-terminali (RWSN-PB2-Strep 3) kadar olan kaynaşmıştr nitelendirdi. Bu rekombinant virüsler enfekte olmuş hücreler arası vRNPs dahil olmak üzere PB2-içeren kompleksleri, bir saflaştırma izin verir. VRNPs saflaştırılmış elde etmek için, enfekte hücre kültürleri ve vRNPs bu hücreler elde lizatları arındırılan afinitesi vardır edilir. Ancak, bugüne kadar kullanılan parçalama işlemleri genel bir nükleaz varlığına rağmen, çoğu zaman sadece verimsiz kromatin bağlı materyali çıkarmak, bir adım deterjan lizis dayalı olarak yapılmıştır.
Bizim ön çalışma nükleer vRNPs büyük bir kısmı geleneksel bir hücre parçalanması sırasında elde olmadığını düşündürmüştür ve bu nedenle afinite saflaştırılmış olamazdı. Bu ekstraksiyon verimini artırmak için, ve non-kromatin bağlı nükleer vRNPs gelen kromatin-bağlı ayırmak için, biz grip virüsü ile enfekte olmuş hücrelerde bir adım bilge Subselüler çıkarma protokolü uyarlanmıştır. Kısaca, bu prosedür ilk hücreden çekirdek ayırır ve daha sonra eriyen nükleer proteinler (burada "nucleoplasmic" fraksiyon olarak adlandırılır) ayıklar.Kalan çözünmeyen nükleer malzeme ardından Benzonase, iki tuz çıkarımı adımları takip belirsiz bir DNA / RNA nükleaz ile sindirilir: İlk 150 mM NaCl ("ch150" olarak adlandırılır) kullanılarak, daha sonra 500 mM NaCl ("ch500") (Şekil 1 ). Bu tuz ekstraksiyon adımları 500 mM NaCl henüz hala yakınlık matrisi tagged vRNPs bağlayıcı izin nükleer vRNPs% 85'inden çözünürleştirmek için yeterli olduğu konusunda bizim gözlemlerimize göre seçilmiştir.
Enfekte olmuş hücrelerin hücre içi fraksiyonasyon sonra, her bir fraksiyondan afinite purify PB2-etiketli vRNPs mümkündür ve protein ve sırasıyla, Western blot ve astar uzantısı, RNA kullanılarak analiz bileşenler. Son zamanlarda, 500 mM NaCl (ch500) 3 ile ekstrakte kromatin fraksiyonu üzerine enfeksiyon sonrası geç noktaları sırasında bu vRNP ihracat kompleksleri şeklinde keşfetmek için bu yöntem kullanılmıştır.
Protocol
Discussion
Birçok çalışmada son zamanlarda bireysel protein ya da grip virüsü enfeksiyonu 8 katılan hücresel ağları tespit ederken, bu etkileşimlerin çoğunluğunun fonksiyonel önemi belirsizdir. Grip virüsü RNA sentezi ve çekirdeğinde 9 karmaşık biofiziksel ve biyokimyasal doğaya kromatin bazlı fonksiyonların mutlak bağımlılığı göz önüne alındığında, yeni teknikler bu fonksiyonları aydınlatmak için gerekli olacaktır. VRNPs bir afinite saflaştırma ile birleştiğinde b…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar RWSN PB2-Strep virüs için Nada Naffakh ve Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
Referenzen
- Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
- Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
- Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
- Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
- Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
- Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
- Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
- Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, . Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
- Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
- Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
- Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA–proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
- Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).
