Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées
Summary
Les virus grippaux répliquer leur génome à ARN en association avec la cellule hôte chromatine. Ici, nous présentons une méthode pour purifier intactes complexes ribonucléoprotéiques virales de la chromatine des cellules infectées. Purifiée des complexes viraux peuvent être analysés à la fois par Western blot et par extension d'amorce de la teneur en protéines et d'ARN, respectivement.
Abstract
Comme tous les virus à ARN à brin négatif, le génome de virus de la grippe est conditionnée sous forme de complexes ribonucléoprotéiques virales (vRNP), dans lequel le génome simple brin est encapsidé par la nucléoprotéine (NP), et associé avec le complexe polymérase trimère constitué de la PA, PB1, PB2 et sous-unités. Cependant, contrairement à la plupart des virus à ARN, virus de la grippe virale effectuer la synthèse d'ARN dans le noyau des cellules infectées. Fait intéressant, la synthèse d'ARNm viral utilise cellulaires pré-ARNm comme amorces, et il a été proposé que ce processus se déroule sur la chromatine 1. Interactions entre la polymérase virale et l'hôte l'ARN polymérase II, ainsi qu'entre le NP et les nucléosomes d'accueil ont également été caractérisées 1,2.
Récemment, la génération de virus grippaux recombinants codant pour une seule Strep-Tag génétiquement fusionnée à l'extrémité C-terminale de la sous-unité PB2 de la polymérase virale (RWSN-PB2-streptococcique 3) a êtrefr décrit. Ces virus recombinants permettre la purification de complexes contenant PB2, y compris, à partir de vRNPs cellules infectées. Pour obtenir purifié vRNPs, des cultures de cellules sont infectées, et vRNPs sont purifiés par affinité à partir de lysats dérivés de ces cellules. Toutefois, les procédures de lyse utilisées à ce jour ont été basées sur une seule étape de lyse détergent, qui, malgré la présence d'une nucléase générale, souvent d'extraire la chromatine liée seul matériau inefficace.
Notre travail préliminaire suggère qu'une grande partie de vRNPs nucléaires n'ont pas été extraites lors de la lyse cellulaire traditionnel, et ne pouvait donc pas être purifié par affinité. Pour augmenter cette efficacité de l'extraction, et de séparer la chromatine liée de la non-chromatine assortis vRNPs nucléaires, nous avons adapté un protocole étape par étape d'extraction subcellulaire à la grippe les cellules infectées. En bref, cette procédure sépare tout d'abord les noyaux de la cellule, puis extraits solubles des protéines nucléaires (appelée ici "nucléoplasmique" fraction).Le reste insoluble nucléaire est ensuite digéré par Benzonase, un ADN non spécifique / ARN nucléase, suivie de deux étapes d'extraction de sel: la première utilisation de NaCl 150 mM (appelé "CH150"), puis 500 mM de NaCl ("ch500") (Fig. 1 ). Ces étapes d'extraction de sel ont été choisis en fonction de notre observation selon laquelle 500 mM de NaCl était suffisante pour solubiliser plus de 85% de vRNPs nucléaires tout en permettant la liaison de vRNPs marqués à la matrice d'affinité.
Après fractionnement subcellulaire des cellules infectées, il est possible de purifier par affinité vRNPs PB2-étiqueté à partir de chaque fraction individuelle et d'analyser leurs protéines et d'ARN en utilisant des composants Western Blot et par extension d'amorce, respectivement. Récemment, nous avons utilisé cette méthode pour découvrir que l'exportation vRNP forme des complexes au cours de points de retard après l'infection sur la fraction la chromatine extraite avec 500 mM de NaCl (ch500) 3.
Protocol
Discussion
Alors que de nombreuses études ont récemment identifié des protéines individuelles ou des réseaux cellulaires impliqués dans l'infection du virus de la grippe 8, la signification fonctionnelle de la majorité de ces interactions demeure incertaine. Compte tenu de la dépendance absolue de la chromatine à base de fonctions pour la grippe virus à ARN de synthèse et de la nature complexe biophysique et biochimique du noyau 9, de nouvelles techniques seront nécessaires pour élucider ces …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Nada Naffakh et Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) pour le virus de RWSN-PB2-Strep.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM-high glucose | Gibco | 11965-092 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | Serva | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | ThermoScientific | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type “B” pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
Referenzen
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