Este protocolo describe la estimulación de los fibroblastos cultivados con ultrasonido pulsado de baja intensidad, que impulsa la formación de adherencias de coordinación y activación de Rac1 imitando la participación de los receptores transmembrana de la matriz, sindecano-4. Este enfoque permite la investigación de una técnica exitosa clínica en el nivel celular, proporcionando oportunidades para el perfeccionamiento de la terapia.
En los organismos multicelulares, comportamiento de la célula está dictado por las interacciones con la matriz extracelular. Consecuencias de la amplia participación de la matriz de la regulación de la migración y la proliferación celular, la secreción e incluso la diferenciación. Las señales que subyacen a cada uno de estos procesos complejos surgen de las interacciones moleculares de los receptores de la matriz extracelular en la superficie de la célula. Las integrinas son los receptores prototípicos y proporcionar un enlace mecánico entre la matriz extracelular y el citoesqueleto, así como algunos de iniciar la cascada de la adhesión dependiente de señalización. Sin embargo, cada vez es más evidente que los receptores adicionales transmembrana funcionar junto a las integrinas para regular tanto la misma integrina y las señales de corriente abajo. El más elegante de estos ejemplos es el proteoglicano transmembrana, sindecano-4, que coopera con α 5 β 1-integrina en la adhesión a la fibronectina. En modelos in vivo demonstrcomió la importancia de sindecano-4 de señalización, como sindecano-4-knock-out ratones muestran retraso de curación debido a la migración de los fibroblastos 1,2 ineficaz. En animales de tipo salvaje, la migración de los fibroblastos hacia una herida se desencadena por la aparición de la fibronectina que las fugas de los capilares dañados y se deposita por los macrófagos en el tejido lesionado. Por lo tanto existe un gran interés en el descubrimiento de estrategias que mejoren la señalización dependiente de la fibronectina y podría acelerar los procesos de reparación.
Los componentes de la integrina mediadas y sindecano-4-mediada de fibronectina-dependientes de señalización pueden ser separados por las células estimulantes con fragmentos de fibronectina recombinantes. Aunque el compromiso de la integrina es esencial para la adhesión celular, ciertas señales de fibronectina-dependientes están regulados por sindecano-4. Sindecano-4 activa la señal de Rac1 protrusiva 3, hace que la redistribución de la integrina 1, factores desencadenantes de contratación de las moléculas del citoesqueleto, como vinculina, al centro de coordinaciónadherencias 4, y por lo tanto induce la migración direccional de 3. Hemos buscado estrategias alternativas para la activación de dichas señales y se encontró que de baja intensidad de ultrasonido pulsado (lúpicos) puede imitar los efectos de la participación sindecano-4 5. En este protocolo se describe el método por el que 30 mW / cm 2, 1,5 ultrasonido MHz, pulsados a 1 kHz (fig. 1) se puede aplicar a los fibroblastos en cultivo (Fig. 2) para inducir la activación y la formación de Rac1 adhesión focal. Estimulación ultrasonido se aplica durante un máximo de 20 minutos, ya que esta combinación de parámetros se ha encontrado que sea más eficaz para la aceleración de la reparación de fracturas clínica 6. El método utiliza fragmentos recombinantes fibronectina a participar α 5 β 1-integrina, sin compromiso de sindecano-4, y requiere la inhibición de la síntesis de proteínas por cicloheximida para bloquear la deposición de matriz adicional por los fibroblastos., El efecto positivo oecografía f en los mecanismos de reparación está bien documentado 7,8, y por entender el efecto molecular de la ecografía en la cultura que debe ser capaz de perfeccionar la técnica terapéutica para mejorar los resultados clínicos.
En este protocolo se describe el método por el cual puede ser un tratamiento que se aplica normalmente a pacientes humanos utilizados en los experimentos basados en células. El objetivo final es comprender el mecanismo molecular de acción de ultrasonido para que la terapia puede ser refinado. En este protocolo, se utiliza fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) como un sistema de células de modelo, pero la ecografía ha sido también ha encontrado que es eficaz en fibroblastos primarios de prepucio humano 5, las células madre mesenquimales, osteoblastos y condrocitos 6. Nuestro método de activación de Rac1 como un ensayo de ejemplo, bioquímica, pero el método puede ser utilizado igualmente para poner a prueba la regulación de la fosforilación de proteínas o la formación de complejos de proteínas por inmunoprecipitación. Para el ejemplo de inmunofluorescencia demostramos una ecografía efecto sobre la formación de adhesión focal, pero la redistribución de cualquier molécula podría ser examinado. Por ejemplo, uno podría poner a prueba la contratación de factores citosólicos a la membrana plasmática, la colocalización de proteins en el tráfico de vesículas o examinar el efecto de los ultrasonidos sobre la organización del huso mitótico. Hasta ahora hemos confinado mismos para probar la fibronectina dependiente de las vías, por el efecto de los ultrasonidos sobre las células en el colágeno, o en presencia de factores de crecimiento podría ser probado para construir una imagen de ultrasonido cómo influye en el comportamiento de la célula en un entorno complejo que más se asemeja mucho a una situación in vivo. Un desafío mayor será para probar el efecto de los ultrasonidos con time-lapse de imágenes, donde la presencia del emisor bloquea la trayectoria de la luz y las vibraciones de los ultrasonidos actuales obstáculos técnicos adicionales. Sin embargo, el hecho de que la aplicación terapéutica requiere sólo 20 minutos de estimulación por día sugiere que el análisis de comportamiento de las células después de una ráfaga de estimulación puede ser productivo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por Wellcome Trust de subvención 088.419 de bancos multilaterales de desarrollo y el patrocinio por Smith & Nephew UK Ltd.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |