Индукция Адгезия зависит от сигналов с низкой интенсивности ультразвука

1. Покрытие поверхности с матрицей лигандов Ультразвуковое будет применяться к ячейкам в 3,5 см скважины, либо как отдельные блюда или 6-луночного планшета. Для биохимических анализов, пальто лиганда непосредственно на пластик. Для иммунофлюоресценции, варить стекло покровные три раза в MilliQ воды и место 4 покровные на дно каждой лунки. Стеклянные поверхности должны быть производные для обеспечения эффективного покрытия лиганда. Растворите сульфо-м-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide эфир в PBS в 1 мм. Добавить 2 мл в каждую лунку и инкубировать 30 минут при комнатной температуре. Вымыть поверхность производные 3 раза PBS. Пальто или производные стекла или пластика с необработанными лигандов интегрина. Применяют по 2 мл 10 мкг / мл интегрина ligand9, растворенного в PBS, содержащем Ca 2 + и Mg 2 + в каждую лунку и инкубировать в течение ночи при 4 ° C. Подготовить monoparticulate BSA путем нагревания 1% BSA, растворенного в PBS, до 85 ° C в течение 13 минут. Позволятьостыть, а затем пройти через 0,45 мкм фильтр. Вымойте лиганда покрытием поверхности 3 раза PBS и блок с monoparticulate BSA в течение 30 минут. 2. Подготовка клетки Для управления матрицей окружающей среды в течение всего эксперимента, синтез белка должны быть заблокированы путем добавления 25 мкг / мл циклогексимид до 80% сливной фибробластов в течение 2 часов. Промыть циклогексимид обработанных клеток PBS и отделить от культуры фляги использовании 0,5 мг / мл трипсина / ЭДТА. Урожай отдельных клеток путем центрифугирования при 500x г в течение 5 минут. Ресуспендирования клеток в DMEM/25 HEPES мМ, 25 мкг / мл циклогексимид. Граф плотность клеток суспензии помощью гемоцитометра и развести в 105 мл-1. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 20 минут для восстановления поверхности интегринов. Промойте лиганда покрытием, BSA-заблокировали лунки 3 раза PBS. Семенной 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку. Аллош клетки распространились в течение 2 часов при температуре 37 ° C, 5% СО 2. 3. Ультразвуковая стимуляция Теплый массива ультразвуковой излучатель и связи гель до 37 ° C. Нанесите горошину капля геля для связи каждого излучателя. Проверьте, что каждый излучатель функционально помощью диодного индикатора ультразвукового детектора. Поместите скважин на эмиттере массива. Возвращает массив до 37 ° C, 5% СО 2 и температуры позволяют, чтобы уравновесить в течение 10 минут. Включите ультразвукового сигнала. Ультразвуковой сигнал отключается после 20 минут, имитируя терапевтический режим. Если сокращение времени стимуляции требуется, плиты должны быть удалены из массива в нужный момент точки. Во всех случаях использование нестимулированных пластин в качестве отрицательного контроля. 4. Фокусное анализ сцепления иммунофлуоресценции Для анализа координационных спаек, применяется 20-минутный ультразвукового сигнала, а затем позволить структуры для разработки еще на 40 минут на поддержание клеток при 37 ° C, 5% СО 2. Аспирируйте СМИ и исправить клеток путем применения 2 мл 4% параформальдегида в ФСБ. Инкубировать 14 минут при комнатной температуре. Аспирируйте параформальдегид и промыть три раза PBS, применяя PBS мягко край колодца, чтобы избежать генерации поперечных сил. Передача каждого из покровного 3,5 см и на 24-луночного планшета для последующего иммунофлуоресцентного окрашивания. Угашайте остаточной параформальдегид, применяя 0,5 мл 0,1 М глицина в PBS в каждом из 24 скважин. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре. Аспирата глицин и промыть три раза PBS. Permeabilise клетки, применяя 0,5 мл 0,5% Тритон Х-100 (вес / объем) в PBS. Выдержите в течение 4 минут при комнатной температуре. Аспирата Тритон Х-100 и промыть три раза PBS. Блока, применяя 0,5 мл 3% (вес / объем) BSA в PBS. Инкубируйте течение ночи при 4-йнапример, C. Пятно винкулин содержащих координационные сцепления с hVIN-1 антител 1:400 разбавляется в блоке БСА. Выдержите в течение одного часа при комнатной температуре. Промыть три раза PBS. Применить флуорофора (DyLight 488) конъюгированные вторичные антитела (разбавленный 1:200) и пятно актина с TRITC-сопряженных фаллоидином (разбавленный 1:200) в блоке БСА. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре. Промыть три раза PBS, и один раз с водой. Установите на предметное стекло в перевернутом положении с помощью Продлить Золото mountant. 5. Количественная Rac1 Активация выпадающего Пробирной Для анализа Rac1 активации, применяется 20-минутный ультразвуковой сигнал в клетки при 37 ° C, 5% СО 2. При оценке ответа раза больше, чем за 20 минут, применять ультразвукового сигнала в течение 20 минут и поддержания клеток при 37 ° C, 5% СО 2 в течение оставшегося времени, чтобы в ответ на развитие. Аспирата СМИ и место хорошос на льду. Промыть скважин с 2 мл холодного PBS и аспирации. Убедитесь, остаточные PBS удаляется, оставляя скважин наклонена в течение 1 минуты с последующим тщательным аспирации. Лизировать клетки на льду с 35 мкл буфера для лизиса (10% глицерин, 20 мМ Hepes рН 7,4, 140 мМ NaCl, 1% NP40, 0,5% натрия Deoxycholate, 4 мм EGTA, 4 мМ ЭДТА, 1 × полный ингибитор протеазы) в каждую лунку. В этом примере, 6 скважин используется в момент времени генерировать 210 мкл клеточного лизата. Более или менее скважин могут быть использованы, но общий объем лизата должна составить ~ 200 мкл. Скрип клетки тщательно клетки скребок, чтобы обеспечить полный лизис клеток и оставить скважин наклонена в течение 1 минуты, чтобы лизат в бассейн. Передача лизата в ледяной 1,5 мл микроцентрифужную трубки (объединение лизатов из одного режима лечения) и спина в 21000 х г в течение 2 минут при температуре 4 ° С до обломков гранул сотовых. Передача 180 мкл лизата в ледяной 1,5 мл микроцентрифужную пробирки, содержащие 130 мкл лизирующего буфера и 25 мкл ПАК-перенасыщениеathione агарозном бусин 10. Держите остальные сырой лизат при -20 ° С для последующего разделения геля. Захват активного Rac1 на ПАК-глутатион бисером агарозном поворотом трубы в течение 40 минут при 4 ° C. Урожай агарозном шарик конъюгатов центрифугированием при 2000 × г в течение 1 минуты при температуре 4 ° C. Wash шарик сопрягает три раза с 500 мкл буфера для лизиса, сбор бисером центрифугированием при 2000x г и отбрасывая супернатант после каждого мытья. Осторожно удалите оставшиеся промывочного буфера лизис с 200 мкл пипетки. Элюирования каждого образца путем добавления 35 мкл SDS-PAGE буфера загрузки и инкубировать при 85 ° C на дрожащей тепло блока в течение 5 минут. Удалить бисером центрифугированием при 21000 х г в течение 1 минуты. Решение шарик элюата на SDS-PAGE, передать нитроцеллюлозы и зонд для Rac1. 6. Представитель Результаты В этом протоколе описываются индукции винкулин-пятноED Фокусное спайки и Rac1 деятельности с помощью ультразвука. Для координационного эксперимент адгезии, базовые позиции является то, что фибробласты распространяется на лигандом α 5 β 1 интегрина не образуют винкулин содержащих спайки (рис. 3А), если второй рецептор фибронектина, syndecan-4, занимается добавлением растворимого лиганда (рис. 3В) 3,4. Тем не менее, стимуляция с помощью ультразвука вызывает координационного спаек в той же степени, как участие syndecan-4 (рис. 3в), о том, что ультразвуковая стимуляция может заменить некоторые компоненты фибронектин-зависимого сигнального пути 5. Главное препятствие этому протоколу устранения координационного спаек в отсутствии стимулятор. Неполное подавление синтеза белка циклогексимид позволит матрицы осаждения, что является достаточным для клеток автоматически стимулировать. Переполнение клеток может привести к низким уровнем адгезии координационного formatioя и плохой ответ на ультразвук, как перекрестные помехи между клетка-клетка и клетка-матрица контакты будут усложнять эксперимент, который предназначен для изоляции одного стимула. В развитие основного анализа мы покажем такой же эксперимент, повторить с фибробластами хватает syndecan-4 (рис. 4). Эти фибробласты еще реагировать на ультразвуковое исследование (рис. 4в), но не реагируют на syndecan-4 лиганда (рис. 4В). Эксперимент с использованием Sdc4 – / – фибробласты показывают, что ультразвук может действительно обойти необходимость определенных рецепторов фибронектин, и показывает, как простой протокол может быть разработан, чтобы получить дополнительную информацию о сигнального пути. Для биохимического эксперимента показали, что ультразвук может вызывать активацию Rac1, используя выпадающее анализа, что является адаптацией метода, описанного Del Pozo и соавт. 10. Осадки активного Rac1 0, 10, 30 и 60 минут после иниtiation ультразвуковой стимуляции показывает, что Rac1 пики активности на 10-30 минут, прежде чем вернуться к исходным (рис. 5). Уничтожается сырой лизатов для винкулин обеспечивает эквивалентную нагрузку между моментами времени. Результат напоминает активации Rac1 на участие syndecan-4 3, но немного более длительным, чем активация фибронектина. Поэтому 8-10 повторов, как правило, необходимы для достижения важных данных. Активация Rac1 несет ответственность за совершение клеток координационных спаек и спайки зарождающейся координационного начинают формироваться на 10-30 минут, совпадающие с Rac1 активации. Как только начаты, эти спайки будет назревать в больших бляшек сцепления показано на рисунках 3 и 4. Рисунок 1. Формы ультразвуковой волны. Ультразвуковое включает прерывистый сигнал 1,5 МГц, что в связи с малой амплитудой (30 мВт / см <sup> 2, пространственное среднее, среднее временное) не имеет тепловой эффект. Рисунок 2. Схема рабочего процесса для подготовки и стимуляции клеток с помощью ультразвука. Рисунок 3. Ультразвуковая индукции координационных спаек в фибробласты. Фибробласты были распространены на интегрин-связывающий фрагмент фибронектина (A) до стимуляции syndecan-4-связывающий фрагмент фибронектина (B) или ультразвука (C). После 60-минутной стимуляции клетки фиксировали, окрашивали для винкулин и актин, и изображено эпифлуоресцентной. Bar = 10 мкм. Рисунок 4. Ультразвуковое индукции координационных спаек в фибробластах отсутствует syndecan-4. <em> Sdc4 – / – фибробластов были распространены на интегрин-связывающий фрагмент фибронектина (A) до стимуляции syndecan-4-связывающий фрагмент фибронектина (B) или ультразвука (C). После 60-минутной стимуляции клетки фиксировали, окрашивали для винкулин и актин, и изображено эпифлуоресцентной. Хотя Sdc4 – / – фибробласты фибронектина регистра, УЗИ еще индуцированных координационными спаек, указывая, что ультразвук обходит матрицу взаимодействия рецепторов. Bar = 10 мкм. Рисунок 5. Активизация Rac1 с помощью ультразвука. Клетки были стимулированы на 0, 10, 30 и 60 минут с 6 скважин использованы в момент времени. Количество ГТФ-Rac1 присутствующих в образцах Rac1 выпадающего конечно время анализа было визуализировать путем инкубации с анти-Rac1 антител на западном пятно (верхний рисунок). Количественная оценка интенсивности полосы (в среднем 8-10 повторяет) показывает, увеличилось Rac1ctivity в результате ультразвукового сигнала в 10 и 30 минут, прежде чем вернуться к исходному уровню на 60 минут (график). Ошибка бары представляют сем