Denne protokollen beskriver stimulering av kultiverte fibroblaster med lav intensitet pulserende ultralyd, som driver fokal heft formasjon og Rac1 aktivisering ved å etterligne engasjement transmembrane matrisen reseptor, syndecan-4. Denne tilnærmingen gjør at etterforskningen av en vellykket klinisk teknikk på cellenivå, og dermed gi muligheter for videreutvikling av terapi.
I flercellede organismer, er celle atferd diktert av interaksjoner med ekstracellulær matrix. Konsekvenser av matrix-engasjement spenner fra regulering av celle migrasjon og spredning, til sekresjon og selv differensiering. Signalene underliggende hver av disse komplekse prosesser oppstå fra de molekylære interaksjoner av ekstracellulær matrix reseptorer på overflaten av cellen. Integriner er prototypic reseptorene og gir en mekanisk kobling mellom ekstracellulær matriks og cytoskjelettet, samt initiere noen av heft-avhengige signalveier kaskader. Men det er stadig tydeligere at ytterligere transmembrane reseptorer fungere sammen med de integriner å regulere både integrin selv og signaler nedstrøms. Den mest elegante av disse eksemplene er det transmembrane proteoglykan, syndecan-4, som samarbeider med α 5 β 1-integrin i løpet av vedheft til fibronectin. In vivo modeller demonstrspiste viktigheten av syndecan-4 signalering, som syndecan-4-knockout mus viser healing utviklingshemning på grunn av ineffektiv fibroblast migrasjon 1,2. I vill type dyr, er migrasjon av fibroblaster mot en såret utløst av utseendet fibronectin at lekkasjer fra skadede blodkar og blir avsatt av makrofager i skadde vevet. Derfor er det stor interesse i å finne strategier som forbedrer fibronectin-avhengige signalering og kunne akselerere reparasjonsprosesser.
De integrin-medierte og syndecan-4-mediert komponenter av fibronectin-avhengige signalering kan separeres ved å stimulere celler med rekombinant fibronectin fragmenter. Selv integrin engasjement er viktig for celle adhesjon, visse fibronectin-avhengige signaler regulert av syndecan-4. Syndecan-4 aktiverer Rac1 protrusive signal 3, fører integrin en omfordeling, utløser rekruttering av cytoskeletal molekyler, slik som vinculin, til fokalsammenvoksninger 4, og dermed induserer retningsbestemt migrasjon tre. Vi har sett etter alternative strategier for å aktivere slike signaler, og fant at lav intensitet pulset ultralyd (LIPUS) kan etterligne effekten av syndecan-4 engasjement fem. I denne protokollen beskriver vi metoden som 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultralyd, pulset ved 1 kHz (Fig. 1) kan brukes til fibroblaster i kultur (Fig. 2) for å indusere Rac1 aktivering og fokal heft formasjon. Ultralyd stimulering er søkt om maksimalt 20 minutter, da denne kombinasjonen av parametre har blitt funnet å være mest effektivt for akselerasjon av klinisk brudd reparasjon seks. Metoden bruker rekombinante fibronectin fragmenter å engasjere α 5 β 1-integrin, uten engasjement av syndecan-4, og krever hemming av proteinsyntesen ved cycloheximid å blokkere deponering av ytterligere matrise av fibroblaster., Den positive effekten of ultralyd på reparasjonsmekanismene er godt dokumentert 7,8, og ved å forstå den molekylære virkningen av ultralyd i kultur bør vi være i stand til å avgrense den terapeutiske teknikken for å forbedre kliniske utfall.
I denne protokollen beskriver vi metoden som en behandling som normalt brukes på menneskelige pasienter kan brukes i celle-baserte eksperimenter. Det ultimate målet er å forstå den molekylære mekanismen av ultralyd handling, slik at behandlingen kan forbedres. I denne protokollen, bruker vi mus embryonale fibroblaster (MEFs) som en modell celle system, men ultralyd er også blitt funnet å være effektiv i primære humane foreskin fibroblaster 5, stamceller og osteoblaster og chondrocytes 6. Vi bruker Rac1 aktivering som et eksempel biokjemiske analysen, men metoden kan brukes like å teste regulering av protein fosforylering eller dannelse av protein komplekser med immunoprecipitation. For immunofluorescent eksempel viser vi en effekt ultralyd på fokal vedheft formasjon, men omfordeling av alle molekyl kunne bli undersøkt. For eksempel kan en teste rekruttering av cytosoliske faktorer til plasma membran, colocalisation av Proteins i smugling blemmer eller undersøke effekten av ultralyd på mitotisk spindel organisasjon. Så langt har vi begrenset oss til å teste fibronectin-avhengige veier, av effekten av ultralyd på celler på kollagen, eller i nærvær av vekstfaktorer kan bli testet for å bygge opp et bilde av hvordan ultralyd påvirker celle atferd i et komplekst miljø som mer ligner en in vivo situasjon. En større utfordring vil være å teste effekten av ultralyd ved hjelp av time-lapse imaging, der tilstedeværelse av emitter blokkerer lyset banen og vibrasjoner fra ultralyd presentere ytterligere tekniske hindringer. Imidlertid tyder det faktum at terapeutisk anvendelse krever bare 20 minutter av stimulering per dag at analyse av celle atferd etter et utbrudd av stimulering kan godt være produktiv.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Wellcome Trust bevilgning 088419 til MDB og sponsing av Smith & Nephew Storbritannia Ltd
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |