이 프로토콜은 초점 유착 형성과 transmembrane 매트릭스 수용체, syndecan-4의 포용을 흉내낸하여 Rac1 활성화를 몰고 낮은 강도 펄스 초음파와 교양 섬유아 세포의 자극에 대해 설명합니다. 이러한 접근 방식함으로써 치료의 섬세한 기회를 제공하고, 세포 수준에서 성공적인 임상 기술의 조사를 허용합니다.
다세포 생물에서는 세포 문제는 세포외 기질과 상호 작용에 의해 결정됩니다. 세포 마이 그 레이션 및 확산 규제에서 분비 심지어 차별화에 매트릭스 – 포용 범위의 결과들. 이러한 복잡한 프로세스 각각의 기본 신호는 세포의 표면에 세포외 기질 수용체의 분자 상호 작용에서 발생합니다. Integrins는 prototypic 수용체이며 기계 세포외 기질과 cytoskeleton 사이의 연결뿐만 아니라 접착 – 종속 신호 폭포의 일부를 시작하고 있습니다. 그러나 추가 transmembrane 수용체가 하류 인테 자체와 신호를 모두 통제하고 integrins 함께 작동하는 점점 명백한지고 있습니다. 이러한 예제의 가장 우아 fibronectin에 부착하는 동안 α 5 β 1-인테 협력 transmembrane의 proteoglycan, syndecan-4입니다. 생체내 모델에서 demonstr가syndecan-4-녹아웃 마우스는 비효율적인 fibroblast 마이 그 레이션 1,2로 인한 치료 지연을 전시로, syndecan-4 신호의 중요성을 먹었어요. 야생 형 동물에 상처 향해 섬유아 세포의 이전이 손상된 모세 혈관의 누출과 부상을 조직의 macrophages에 의해 침전되는 fibronectin의 모양에 의해 트리거됩니다. 따라서 fibronectin 종속 신호를 향상시키고 복구 프로세스를 가속화할 수있는 전략을 발견에 큰 관심이 있습니다.
fibronectin 종속 신호의 인테 그린 – 중재와 syndecan-4-매개 구성 요소는 재조합 fibronectin의 파편 자극 세포로 구분 할 수 있습니다. 인테 그린 결합은 세포 부착에 필수이지만, 특정 fibronectin 종속 신호는 syndecan-4에 의해 규제됩니다. Syndecan-4를 활성화 Rac1 밀어내는 신호 3 초점으로 인테 재배포 1 등 vinculin 같은 cytoskeletal 분자의 트리거 모집을 일으키는adhesions 4 및함으로써 방향 마이 그 레이션 3 유도합니다. 우리는 그러한 신호를 활성화하기위한 대안 전략에 대해 검토한 결과, 낮은 강도 펄스 초음파 (LIPUS)는 syndecan-4 교전 5 효과를 흉내내는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜에서는 1 kHz에서 (그림 1)에서 펄스 30 MW / cm 2, 1.5 MHz의 초음파가, Rac1 활성화 및 초점 유착 형성을 유도하기 위해 문화의 섬유아 세포 (그림 2)에 적용할 수있는하는 방법을 설명합니다. 매개 변수의 조합 임상적 골절 수리 6 가속을위한 가장 효과있는 것으로 판명되었습니다로 초음파 자극은 20 분 최대 적용됩니다. 방법은 syndecan-4의 참여없이 α 5 β 1-인테 그린을 참여시키는 재조합 fibronectin 조각을 사용하며 섬유아 세포에 의해 추가로 모체의 증착을 차단하는 cycloheximide에 의한 단백질 합성의 억제가 필요합니다., 긍정적인 효과 O수리 메커니즘의 F에 초음파가 잘 7,8를 문서화하고 있으며, 문화 초음파의 분자 효과를 이해함으로써 우리는 임상 결과를 개선하는 치료 기법을 좁힐 수 있어야합니다.
이 프로토콜에서는 일반적으로 인간의 환자에 적용되는 치료는 세포 기반 실험에 사용할 수하는 방법을 설명합니다. 궁극적인 목적은 치료가 세련 수 있도록 초음파 행동의 분자 메커니즘을 이해하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 모델 전지 시스템으로 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 사용하지만, 초음파는 기본 인간 포피의 섬유아 세포 5, mesenchymal 줄기 세포, osteoblasts와 chondrocytes 6에 효과적인 것으로 발견되었습니다. 우리는 예를 생화 학적 분석으로 Rac1 정품 인증을 사용하지만 방법은 똑같이 단백질 인산화 또는 immunoprecipitation에 의한 단백질 단지 형성의 규제를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. immunofluorescent 예를 들어 우리는 초점 유착 형성에 효과 초음파를 보여주지만, 어떤 분자의 재배포는 검사 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 prote의 colocalisation, 플라즈마 막에 cytosolic 요인 채용을 테스트할 수인신 매매 vesicles의 기능이나 mitotic 스핀들 조직에 대한 초음파의 효과를 검사합니다. 지금까지 우리는 다른 콜라겐에 대한, 또는 성장 요인의 존재에 초음파 검사가 복잡한 환경에서 세포의 행동에 미치는 영향의 사진을 만들어 테스트할 수있는 세포에 대한 초음파의 효과에 의해, fibronectin 종속적인 경로를 테스트하는 데 국한되어있다 그 이상 밀접하게 관련 생체내 상황은 비슷합니다. 큰 도전은 방출의 존재는 초음파 현재 추가적인 기술적 장애물에서 빛의 경로와 진동을 차단 촬영된 이미지를 사용하여 초음파의 효과를 테스트하는 것입니다. 그러나, 치료 응용 프로그램은 하루에 자극을 불과 20 분 거리가 필요하다는 사실은 자극 버스트 후 셀 동작의 분석을 잘 생산있을 수 있습니다 제안합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 스미스 & 조카 영국 회사에 의해 MDB와 후원으로 Wellcome 신탁 기금 088,419에 의해 지원되었다
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
sulpho-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester | FisherPerbio | PN22312 | 25 mM stocks dissolved in water can be stored at -20°C |
6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | Plastic from other companies can coat poorly |
13-mm glass coverslip | Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS | MIC3336 | Glass from other companies can coat poorly |
PBS | Sigma | D8537 | |
PBS, Ca2+ Mg2+ | Sigma | D8662 | |
50K integrin ligand (fibronectin fragment) | Construct description and preparation in 9, 11 | Alternative matrix ligands could be used to interrogate other pathways | |
BSA | Sigma | A3059 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698 | Can be stored as 10mg/ml stock in water |
DMEM/25 mM HEPES | Sigma | D6171 | |
Exogen 4000+ | Smith & Nephew Inc | ||
Ultrasound coupling gel | Smith & Nephew Inc | ||
SAFHS indicator | Smith & Nephew Inc | ||
hVIN-1 | Sigma | V9264 | |
DyLight 488-conjugated anti-mouse | Stratech Scientific | 715-485-150 | |
TRITC-labelled phalloidin | Sigma | P1951 | |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
cOmplete protease inhibitor (EDTA free) | Roche | 056 489 001 | 100× stock made up from tablet stored at -20°C |
PAK-glutathione agarose beads | Construct description and preparation in 10 | ||
Glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
Hepes | Apollo Scientific | BI8181 | Make 1M stock and pH to 7.4 |
NaCl | Fisher | S/0160/65 | |
NP40 | Sigma | I3021 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
EDTA | Sigma | E5134 |