İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

Bu yöntem, Boland ve ark. Nature bildirilen araştırmada kullanılmıştır. 461, 91-96 (2009). 1 1. Lentivirus hazırlanması Bu protokol bir Teto yanıt elemanı kontrolü altında Oct4 için Sox2, Klf4, ve c-myc encode doksisiklin-indüklenebilir lentiviral mekik vektörleri kullanmaktadır. Transgenlerin doksisiklin varlığında yeniden programlanması faktör ekspresyonuna sebep olur ters tetrasiklin trans aktive edici protein, rtTAM2.2 16 ile aktive edilir. Bu sistem, yeniden programlanması faktörlere sıkı kontrol, yüksek ifade için olanak sağlar. Burada kullanılan lentiviral vektörleri kendini etkisiz olduğu ve bu nedenle aşağıdaki genomik entegrasyon çoğaltamıyor. Lentiviruses ile çalışan ve BSL-2 (ABD) ve S2 (Avrupa) standartlarına uyumlu laboratuvarlarda yapılmalıdır Ancak, dikkatli olunmalıdır. En az bir kez tra önce HEK293T hücreleri ve geçit çözülmensfection. Hücreler 37 HEK orta yoğunlukta subconfluent tutulmalıdır ° C,% 5 nemlendirilmiş bir ortam içinde CO2. 1:06-01:10 bir split oranı ile rutin pasaj hücreler 2 günde. Tohum ~ 8 x 10 6 25 ml HEK orta HEK293T cells/T150. Her bir lentivirüs hazırlanması için bir T150 kullanın. Kalsiyum fosfat çökeltme ile ertesi gün hücrelerin transfekte HEK293T. (Not: Elimizdeki kalsiyum fosfat çökeltme rutin olarak% 80-90 transfeksiyon verimi ile sonuçlanır, ancak bu tür lipofektamin 2.000 katyonik lipid transfeksiyon reaktifler de kullanılabilir). Hazırlanması için her bir virüs için iki adet 15 ml'lik konik bir tüp hazırlanır. "A" ve "B" tüpleri etiketleyin. Tüp A, her biri 10 ug: lentiviral mekik vektörünün kodlama yeniden programlanması faktörleri (ya da rtTAM2.2), viral paketleme vektörler, ve plasmid kodlama viral zarf proteini VSVg. Tüp A 186 ul 2 M CaCl2 ekleyin ve steril H 2 O ile 1.5 ml hacimleri getirir. Tüp B: 1.5 mL 2x HBS (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılır.) Bir homojen çözelti kadar Tüp A içinde karışım pipet. A B çözeltisi damla damla çözeltisi ekleyin ve 2-3 dakika oda sıcaklığında bekletin. HEK293T hücrelerinin büyümesini orta aspire ve 22 ml önceden ısıtılmış HEK penisilin olmadan orta ve streptomisin ile değiştirin. Pipet kombine çözümler AB (kalsiyum fosfat çökelti) doğrudan hücre HEK293T ve hafif sallanan tarafından eşit şekilde dağıtmak. Lentivirüs ile HEK-293T hücrelerin transfeksiyon sonra 24 saat, büyüme orta kaldırmak ve taze, önceden ısıtılmış HEK orta 25 ml ile değiştirin. Inkübatör transfekte Heks dönün. 48 saat lentivirüs ile HEK-293T hücreleri transfeksiyondan sonra, transfekte edilmiş heks dan lentiviral parçacıkları içeren büyüme ortam toplamak. 5 dakika 4 ° C'de 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat çözelti viral partikül artıkları kaldırma Ultrasantrifügasyon uçtan bir uca tarafından virüs Konsantreöf 4'te 112,000 x g'de 2 saat için bir% 20 sakroz yastığı (2 mi sucrose/25 ml viral süpernatant) ° C. Nazik sallama ile 15-30 dakika boyunca 4 ° C'de 0.4 ml EMB orta viral pelet süspanse edin. -80 Tek kullanımlık alikotları (yani 50 ul) viral parçacıkların saklayın ° C 2. Yeniden programlanması için Fare Embriyonik Fibroblast hazırlanması (MEF) Not: Burada açıklanan protokol TEC tahlillerde kullanılmak için E 13.5 fare embriyonik fibroblastlardan iPSCs bir türetme ile ilgilidir. Diğer gruplar yetişkin donör hücre kaynaklarından tüm IPSC farelerde oluşturulan olmasına rağmen, biz diğer hücre türleri üzerinde bu yöntemi test değil ve donör hücre tipi bir faktör değildir emin olamaz. Fare zamanlamalı çiftleşmelerin ayarlayın. Embriyonik gün 13.5 (E13.5) üzerinde, hamile kadın ötenazi ve rahim boynuzları gelen embriyolar teşrih. Buz üzerinde 1x PBS içinde yer ve mağaza embriyolar (4 ° C kadar önceden soğutulmuş). Extraembryonic dokular (yani kaldırkoryon, amniyon ve plasenta). Embriyo başını kesmek ve kuyruk kaldırmak (opsiyonel – genotipleme için gerekirse) ve bacaklarda. Iç organları, kullanarak forseps veya bir kepçe biçimli bir mala boaltınız ve bir neşter veya keskin makas bıçağı ile kalan karkas kıyma. 5 ml önceden soğutulmuş 1x PBS kıyılmış karkas yıkayın. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant aspire. 37 5 ml% 0.25 tripsin-EDTA ve inkübe pelet Askıya ° C dinç 20-30 dk sallayarak. EMB ortam (37 ° C'de ön-ısıtılmış), 5 dakika boyunca 200 x g ile santrifüj karışımı 5 ml ilave edilir. Önceden ısıtılmış MEF ortamda süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet aspire. % 0.1 jelatin ile önceden kaplanmış bir 6-kuyulu plakanın kuyularının 2-3 Plak ayrışmış MEFS. Bu pasaj 1 olarak kabul edilir. 1:04-01:05 her 48 saat dilusyondaki Passage MEFS. Geçit 3'te MEFS lentiviral transdüksiyon için hazırız. 3. IPSC Hatları türetilmesi Lentiviral transdüksiyon önceki gün; tohum ~ 3 x 10% 0,1 jelatin ile önceden kaplanmış bir 6-plaka çok iyi birine 5 ilköğretim MEFS. 1. Gün: Birincil MEFS lentiviral transdüksiyon için 80-90% konfluent olmalıdır. 37 gece boyunca MEFS ile doğrudan MEF ortam ve inkübe lentiviral parçacıklar ekleme ° C'de nemlendirilmiş bir ortam içinde% 5 CO2. Ertesi gün (2 gün) orta aspirat ve viral parçacıkların kaldırılması için 1x PBS 3 ml ile iki kez yıkayın. 0.5 ml önceden ısıtılmış ara sıra sallama ile 3-5 dakika için 37 hücreleri ile inkübe ° C ila% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için öğütmek. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için ışık mikroskobu ile hücrelerin gözlemleyin. 5 ml MEF medya içeren 15 ml konik tüp içine Transferi MEFS. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin. MEF orta süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe aspire. Eşit bir 6 kuyu p iki kuyu arasındaki hücre süspansiyonu bölünmüş% 0.1 jelatin ile önceden kaplanmış geç. Ileri ve geri plakası Kaya, yan yana, ve bir kez iyi boyunca hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için dairesel bir hareket. 37 ° C'de gece boyunca inkübe, nemlendirilmiş bir ortam içinde% 5 CO2. 3. Gün: Tekrar% 0.1 jelatin ile 6 plaka önceden kaplanmış 3 kuyu iyi birinden eşit hücreleri bölme hariç 4-9 adımları yineleyin. Bu birincil fibroblastlar transduced 6 kuyu verecektir. Gün 4: 10 ug / ml 5/6 kuyu için bir konsantrasyonda Ekleme doksisiklin (DOX). Bir iyi bir kontrol olarak hizmet için arıtılmamış kalmalıdır. Dox ile tedavi 5 kuyu 1.9 mM 3'te VPA ekleyin. VPA MEFS proliferasyon hızını azaltır. Subconfluent kültürleri 2-5 gün içinde senesce eğilimindedir, oysa MEFS yoğun kültürleri VPA uzun süreli maruz tolere. Bu nedenle, MEFS VPA ilave edilir% 100 birbirine karışan olmalıdır. Not: Bu bilinen bir epigenetik değiştirici, ve sh olmuştur çünkü bizim reprogramming deneylerde VPA kullanımıtam pluripotent IPSC hatları oluşturmak bakımından etkileri ve VPA etki mekanizması bilinmemekle birlikte, IPSC kuşak 17 etkinliğini arttırmak için kendi. 5. Gün:, orta aspire önce olduğu gibi hücrelerin yıkayın ve Trypsinize. Taze dox ve VPA ile takviye ES hücre ortamında önceden kaplanmış 10 cm tabaklar 2 ile% 0.1 jelatin ve diğer koşulların her biri ile önceden kaplanmış 15 cm2 doku kültürü çanağı dox / VPA ile tedavi edilen geçiş hücreleri. Taze Ortodoks ve VPA ile takviye ESC orta her gün hücrelerin yenileyin. ESC benzeri koloniler dox / VPA tedavisi ~ 7 gün sonra ve dox yalnız tedavisinde ~ 10 gün sonra ortaya çıkmaya başlar gerekir. Resim koloniler dox tedavi yokluğunda yer almalıdır. Sonra koloniler, iyi tanımlanmış sınır parlak bir refraktif sahip ve 30-50 hücreler içeren, elle 0 20 ul içeren bir U-alt 96 plaka bir jel yükleme pipet ve transferi ile koloniler izole.25% Tripsin-EDTA. Tek hücrelere Trypsinize ve yalnız dox / VPA veya dox içeren 150 ul ESC ortamda düz dipli 96 plaka besleyiciler aktarmak. Klonal ESC ortamda besleyiciler üzerinde izole IPSC hatları genişletmeye devam edin. Bunların yanı sıra (post-transdüksiyon gün 23) gün sonra 19 Ortodoks ve VPA çıkarın. Kendini yenileme veya ESC denetimleri benzer proliferasyon oranlarını korumak yok IPSC çizgiler atın. Bu TEC gerçekleştirmeye çalışmadan önce EKH ilişkili olarak IPSC çizgiler karakterize etmek için yararlı olabilir. Biz 1) endojen pluripotency immünsitokimya, 2 belirteçleri (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog)) kromozom sayımı ile karyotip analizi ve 3) embriyoid vücudun oluşumu ifadesi bizim çizgiler karakterize etmiş. Bir de lentiviral özgü RT-qPCR proviral transgenlerin iPSCs ifade olmadığını teyit etmek için yapabilir. Ancak, biz sadece morfoloji, immun ve karyotyp kullanarak tam pluripotent iPSCs belirlediking. Deneylerde, biz genellikle potansiyel anormal karyotip ile birkaç satır pluripotency belirteçler eksprese hatlarının çoğunda ESC benzeri morfolojisi ve büyüme özellikleri sonuçlarına göre IPSC hatları seçimi tespit ederken. 4. Blastosist Enjeksiyon için iPSCs hazırlanması PSC hattı kanal adedi ile bu hat 19 bağlı olabilir, ancak onun pluripotency 18 etkilediği gösterilmiştir. Biz yetişkin tüm IPSC fareler üretmek için pasajlardan 8-14 iPSCs kullandık. Çözülme iPSCs ve ESC orta besleyiciler üzerinde plaka. Passage enjeksiyon kullanmadan önce besleyiciler ile ilgili en az bir kez hücreler. % 70-80 oranında konfluent iPSCs ihtiva eden bir 6-plaka arasında iyi bir enjeksiyon için hücrelerin yeterli sayıda daha fazla sağlayacaktır. Büyüme ortamı aspire ve ~ 3 ml 1 x PBS (Ca2 + / Mg2 + içermeyen) her hücreleri yıkayın. 0.5 ml önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA ekleyinAra sıra sallanan ile 10 dakika süreyle 37 ° C de ve hücreler inkübe. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için öğütmek. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için ışık mikroskobu ile hücrelerin gözlemleyin. IPSCs koloniler / hücre agrega enjeksiyon pipeti yapışmasına neden olacak gibi tek bir hücre süspansiyonu olması gerekiyor. Tek bir hücre süspansiyonu ben elde sonra, kuyu için 1.0 ml ESC medya ekleyin ve 37 ° C inkübatör için plaka döner. ~ 15 dakika inkübe veya besleyiciler çoğunluğu uymak başladı kadar. Yavaşça zayıf yapışık besleyiciler çıkarmak için özen iPSCs içeren orta kaldırmak. 5 ml ESC ortam ihtiva eden bir 15 ml'lik konik bir tüp içinde iPSCs yerleştirin. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve bir mikropipet ile ES hücre orta kalan çıkarın. 0.2-0.5 ml önceden soğutulmuş FHM ortam içinde pelet ve nazikçe tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak için tüp dokunun. Kadar ve tetraploid b içine enjeksiyon sırasında buz üzerinde saklayın hücrelerilastocysts. 5. Tetraploid Blastosistler Üretimi Bu bölümde yapılan işlemler başka 5,6,20 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Burada BTX Elektro Hücre Manipülatörü ECM 2001 için optimize bizim teknik, anahat. PMS ve HCG emişli 23-28 gün yaşlı dişi farelerde (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) embriyo donör fare ayarlayın. Daha sonra HCG 47 saat arasında 02:00 ve 5 IU PMS 5 IU Yönet. HCG enjeksiyonundan sonra, C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 damızlık erkek ile dişi fareler kurdu. Vajinal fişleri için ertesi gün kontrol edin. Ötenazi dişi farelerde takılı ve yumurta kanalları toplamak. Hyaluronidaz ile FHM Fallop borularının yerleştirilmesi ve yavaşça ampulae yırtarak 1 hücreli embriyolar toplayın. Kümülüs kitleler 5-7 dk için FHM / Hyaluronidaz içinde bekletin. Bir ağız pipet kullanarak 1-hücreli embriyo toplayın ve KSOM koymadan önce FHM medya damla yoluyla yıkayın-AA kültürü. Kültür 37 ° C'de,% 5 lik bir gecede mineral yağ altında CO 2 ve 2 hücreli embriyolar elektrofüzyon gününde embriyolar seçmek tüm diğer atın. 10 cm Petri kabındaki BTX Microslide yerleştirin. Çözüm slayt, ama çok elektrot direkleri tamamen batık değil o batığın kadar oda sıcaklığında elektrofüzyon medya dökün. ECM 2001 ve BTX Artırıcı 400 açın. Microslide en elektroduna ECM'nin kabloları bağlayın ve slayt istenmeyen hareketi önlemek için Petri kabı tarafına kabloları sabitleyin. BTX arttırıcı bir okuma almak ve uygulanan AC / DC akım gerilim Unutulmaması gereken bir el çarkı çalıştırın. AC akım embriyoların elektrotlar arasında hizalamak hızını kontrol edecek, DC akım blastomer kaynaştırmak, ve darbe zamanı DC darbe uzunluğu ayarlanır. İyi bir başlangıç ​​noktası AC 3V DC 100V, ve zaman 0.05 msn olduğunu. Optimal DC 90-150 volt aralığı içinde değişmektedir. </li> Bir ağız pipet kullanarak, KSOM-AA kültürü 30-40 iki hücreli embriyo sürer ve elektrofüzyon orta birkaç damla ile yıkayın. Ağız pipet içine microslide yemeğin taze elektrofüzyon medya çizin ve yıkama embriyolar alır. Microslide üzerindeki elektrotlar arasında 1 mm boşluk koyun. Onlar boşluğun ortasında aşağı ve birbirleri ile temas halinde olmadığını hizalanmış olduğunu dikkatli olun. Manüel darbe düğmesine basarak AC akım uygulayın. Blastomer temas düzlemi elektrotlar paralel olana kadar embriyo, AC alanına dönecektir. Embriyolar birkaç saniye içinde hizalı değilse, AC ayarını artırın. Embriyolar hizalı sonra, DC darbe uygulamak için tekrar manuel darbe düğmesine basın. Pipet içinde elektrofüzyon orta ile microslide gelen embriyolar toplamak. KSOM-AA birkaç damla yoluyla embriyolar yıkayın ve 37 KSOM-AA kültür koyun ° C,% 5 CO2. Blastomer füzyon shokültür içinde en az 30 dakika içinde tamamlanır uLd. Tekrar 2-hücreli embriyo kalan için 7-11 adımları yineleyin. Sonraki füzyon grupların ardından, izlemek ve erimiş blastomer ile embriyolar seçin. Başarıyla erimiş embriyolar 1-hücreli aşamasında olduğu görünecektir. Kültür içinde 30 dakika sonra lize ve 2 hücreli embriyolar atın. Füzyon oranının altında% 80 ise, 5V ve 0.01 msn artışlarla gerilimi ve / veya süresini artırın. Lizis% 20 üstünde ise, DC gerilim ve / veya zaman buna göre azalır. Bizim deneylerde optimum ayarları AC 4V, DC 146V ve 0.07 msn idi. Bu ayarlar sürekli% 90 veya az veya hiç lizis ile yüksek füzyon oranı vermiştir. 37 mineral yağ altında KSOM-AA microdrops kültür sigortalı embriyolar ° C,% 5 CO 2 ile devam edin. Sen inkübasyondan 48 saat sonra tetraploid (4n) blastokist oluşturmak için erimiş embriyoların% 85-95 beklemesin. 6. Tetraploid Blastosistler içine iPSCs Mikroenjeksiyon Biz Nikon TE-2000U kullanımıinverted mikroskop blastosist enjeksiyon için DIC optik ve Narishige mikromanipülatörler ile donatılmıştır. Her tetraploid blastosist önceki vallahi yayında 5,20,21 ortaya konmuştur fare blastokist içine ESC enjeksiyon için bir standart protokolü kullanarak 10-12 iPSCs ile enjekte edilir Konkav bir mikroskop slaydı merkezinde FHM bir 20 ul düşüş yerleştirin ve mineral yağ, 150 ul ile kapağı. FHM damla içine tutarak pipet ve mikroenjeksiyon iğne indirin. Hem iğneler için 2-3 dk kısmen FHM ile dolmasını sağlayın. FHM ve mikroskop lamı üzerine FHM damla transfer damla yoluyla 20-30 tetraploid blastokist yıkayın. Damla içine Ağız pipet IPSC karışımı. Bu, hücre ya da çok konsantre toplanır önceden eğer FHM bir damla hücre karışımı seyreltik için gerekli olabilir. Enjeksiyon iğnesi ile 100-200 hücre seçin. Saat 9 varsaymak içinde iç hücre kütlesi ile blastosist tutuniyon. Saat 3 hizasında zona pellucida ve trofoblast nüfuz ederek blastocoel içine hücreleri enjekte. Blastosist başına 16-18 hücreleri enjekte edilir. KSOM-AA kültürüne IPSC tamamlanmaktadır blastokist dönün. 7. Alıcı Mice Uterus Kornalar içine tamamlanmaktadır Tetraploid blastokist transferi Tamamlanmaktadır tetraploid blastokist cerrahi kısaca özetlemek olacaktır standart tekniği 20 kullanılarak, araştırmacının enstitü kurallarına göre dişi alıcı farelerin rahim boynuzları aktarılır. Pro-östrus aşamada dişi CD-1 fare seçin ve Vasektomi erkek ile çiftleşme için onları kurmak. Ertesi sabah vajinal fişleri kontrol edin. Dişiler fişi (2.5 DPC) tespit edildikten iki gün sonra uterin embriyo transferi için hazırız. Alıcının kadın Vasektomi erkek ile evlendirilen önce bir gün, olmayan Vasektomi erkek ile ek CD-1 kadın kurmaksezaryen tarafından alınan tüm-IPSC fareler için koruyucu anne olarak kullanılır. 8. IPSC türetilmiş Pups arasında Sezaryen ve Hızlandırılması Implantasyon sonrası birden rezorpsiyonlarının TC embriyo transferi genellikle sonuçları, IPSC veya ESC hattı yüksek gelişim potansiyeline sahip olsa bile. Sonuç olarak, bir alıcı için fazla 4 uygun yavrusu (genellikle 1-2) beklenebilir. Bu küçük yavrular genellikle alıcılar tarafından ihmal edilir. Yenidoğan bakım düzeyi ve hayatta kalma oranını arttırmak için, sezaryen gerçekleştirmek ve standart protokoller 20 göre teşvik. Sezeryan gerçekleştirmek için, 7-08:00 (alıcı 18.5 DPC), 16 gün embriyo transferi sonrası alıcı fareler ötenazi ve rahim boynuzları gelen yavrular teşrih. CD-1 annelere teslim ibrelerin aynı gün canlı yavrular Foster.