Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Deze methode werd in het onderzoek in Boland et al.. Nature. 461, 91-96 (2009) 1. 1. Bereiding van Lentivirus Dit protocol maakt gebruik doxycycline-induceerbaar lentivirale shuttle vectoren die coderen voor Oct4, SOX2, Klf4 en c-Myc onder besturing van een tetO response element. Transgenen worden geactiveerd door de omgekeerde tetracycline trans-activerend eiwit, rtTAM2.2 16, dat herprogrammering factor expressie in aanwezigheid van doxycycline induceert. Dit systeem maakt strak gecontroleerde, hoge expressie van herprogrammering factoren. De lentivirale vectoren hier gebruikte zelf-inactiverende en dus niet repliceren volgende genomische integratie. Echter, is voorzichtigheid geboden bij het werken met lentivirussen en dient te worden uitgevoerd in laboratoria conform BSL2 (USA) en S2 (Europa) normen. Ontdooi HEK293T cellen en doorgang ten minste een keer eerder transfection. Cellen worden gehandhaafd op subconfluente dichtheid in HEK medium bij 37 ° C, 5% CO2 in een vochtige omgeving. Routinematig passage cellen om de 2 dagen met een split ratio van 1:06-1:10. Seed ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 met 25 ml HEK medium. Gebruik een T150 per lentivirus preparaat. De volgende dag transfecteren HEK293T-cellen door calciumfosfaatprecipitatie. (Opmerking: in onze handen calciumfosfaatprecipitatie routinematig resulteert in 80-90% transfectie efficiëntie, maar kationische lipide transfectie reagentia zoals Lipofectamine 2000 kan ook worden gebruikt). Bereid twee 15 ml conische buizen voor elk virus te bereiden. Label de tubes "A" en "B". Buis A, 10 pg van elk van: het lentivirale shuttle vector codeert herprogrammering factoren (of rtTAM2.2), de virale vectoren verpakking en plasmide coderend voor het virale manteleiwit, VSVg. Voeg 186 ul 2 M CaCl2 tot Tube A en breng het volume op 1,5 ml met steriel H2O. Buis B: 1,5 ml HBS 2x (voorverwarmd tot kamertemperatuur). Pipetteer het mengsel in Buis A tot het een homogene oplossing. Toevoegen oplossing A oplossing B druppelsgewijs en laten staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten. Verstuif groeimedium van HEK293T cellen en vervangen door 22 ml voorverwarmd medium zonder HEK penicilline en streptomycine. Pipetteer gecombineerde oplossingen AB (calciumfosfaat precipitaat) rechtstreeks naar de cellen HEK293T en verdeel gelijkmatig door zachte wiegen. 24 uur na transfectie van HEK-293T cellen met lentivirus, groeimedium verwijderen en vervangen door 25 ml verse voorverwarmde HEK medium. Terug getransfecteerde heks in de incubator. 48 uur na transfectie van HEK-293T cellen met lentivirus, verzamelen groeimedia bevattende lentivirale deeltjes van de getransfecteerde heks. Verwijderen deeltjes vuil uit de geoogste virale oplossing door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Concentreer virus door ultracentrifugatie through 20% sucrosekussen (2 ml sucrose/25 ml viraal supernatant) gedurende 2 uur bij 112.000 xg bij 4 ° C. Suspendeer virale pellet in 0,4 ml MEF bij 4 ° C gedurende 15-30 min onder zachtjes schudden. Bewaar virusdeeltjes in aliquots eenmalig gebruik (50 pl) bij -80 ° C. 2. Voorbereiding van muis embryonale fibroblasten (MEF) voor het herprogrammeren Opmerking: Het protocol hier beschreven heeft betrekking op de afleiding van iPSCs van E 13,5 muis embryonale fibroblasten voor gebruik in TEC-assays. Terwijl andere groepen hebben gegenereerd all-IPSC muizen uit volwassen donorcel bronnen, hebben we niet getest deze methode op andere celtypes en kan niet zeker van zijn dat de donor celtype geen rol speelt. Stel de muis getimede paringen. Op embryonale dag 13,5 (E13.5), euthanaseren de zwangere vrouw en ontleden de embryo's uit de baarmoeder horens. Plaats en opslaan embryo in 1x PBS (pre-gekoeld tot 4 ° C) op ijs. Verwijder de extra-embryonale weefsels (bijv.chorion, amnion en placenta). Onthoofden het embryo en verwijder de staart (optioneel – indien nodig voor genotypering) en ledematen. Schep de inwendige organen, met behulp van een tang of een bolletje gevormd spatel en gehakt de resterende karkas met het lemmet van een scalpel of een scherpe schaar. Was de gehakte karkas in 5 ml voorgevulde gekoeld 1x PBS. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant. Suspendeer pellet in 5 ml 0,25% trypsine-EDTA en incubeer bij 37 ° C met krachtig schudden gedurende 20-30 min. Voeg 5 ml van MEF medium (voorverwarmd tot 37 ° C), mengen en centrifuge bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer pellet in voorverwarmde MEF medium. MEFs plaat los in 2-3 putjes van een 6-wells plaat vooraf bekleed met 0,1% gelatine. Dit wordt beschouwd passage 1. Passage MEFs bij een verdunning 1:04-01:05 per 48 uur. MEF bij doorgang 3 zijn klaar voor lentivirale transductie. 3. Afleiding van IPSC Lines De dag voor lentivirale transductie; zaad ~ 3 x 10 5 primaire MEFs in een putje van een 6-well plaat vooraf bekleed met 0,1% gelatine. Dag 1: Primaire MEF moet 80-90% confluentie voor lentivirale transductie zijn. Voeg lentivirale deeltjes rechtstreeks MEF media en incubeer met MEFs nacht bij 37 ° C, 5% CO2 in een vochtige omgeving. De volgende dag (dag 2) aspireer het medium en was tweemaal met 3 ml 1x PBS om virusdeeltjes te verwijderen. Voeg 0,5 ml voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA aan de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 3-5 min met af en toe schudden. Tritureer een enkele celsuspensie te bereiken. Acht cellen door lichtmicroscopie om een ​​enkele celsuspensie te waarborgen. Transfer MEFs in een 15 ml conische buis met 5 ml MEF media. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer cellen voorzichtig in MEF medium. Gelijk verdeeld tussen de celsuspensie twee putjes van een 6 goed plate vooraf bekleed met 0,1% gelatine. Rock de plaat heen en weer, van links naar rechts, en een keer in een cirkelvormige beweging om een ​​gelijkmatige verdeling van cellen in de put te bereiken. Incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 in een vochtige omgeving. Dag 3: Herhaal stappen 4-9 behalve gelijk verdeeld cellen van de ene naar 3 putjes van een plaat met 6 putjes vooraf bekleed met 0,1% gelatine. Dit levert 6 putjes van getransduceerde primaire fibroblasten. Dag 4: Voeg doxycycline (DOX) bij een concentratie van 10 ug / ml tot 5/6 putjes. Een goed blijven onbehandeld te dienen als een controle. Voeg VPA op 1.9 mm tot 3 van de 5 putjes behandeld met dox. VPA vermindert de proliferatie snelheid van MEF. Dichte culturen van MEF tolereren langdurige blootstelling aan VPA terwijl subconfluente culturen hebben de neiging om senesce binnen 2-5 dagen. Derhalve MEF 100% confluent bij VPA wordt toegevoegd. Opmerking: Wij gebruiken VPA in onze herprogrammering experimenten, omdat het een bekende epigenetische modifier, en is shzelf om de doeltreffendheid van iPSC generatie 17 Hoewel de invloeden en mechanismen van VPA actie met betrekking tot het genereren van volledig pluripotent iPSC lijnen niet bekend toenemen. Dag 5: Zuig het medium en trypsinize Spoel de cellen als voorheen. Passage de cellen behandeld met dox / VPA een 15 cm 2 weefselkweekplaat vooraf bekleed met 0,1% gelatine en elk van de andere voorwaarden voor een pre-coated 10 cm 2 schalen in ES cel medium aangevuld met verse dox en VPA. Vul cellen elke dag met ESC-medium aangevuld met verse dox en VPA. ESC-achtige kolonies moeten beginnen te verschijnen na ~ 7 dagen in de dox / VPA behandeling en na ca. 10 dagen in de dox staande behandeling. Geen kolonies moet in de afwezigheid van Dox behandeling. Zodra een heldere kolonies bezitten brekingsindex, goed gedefinieerde grenzen en bevatten 30-50 cellen handmatig isoleren de kolonies met een gel loading pipetpunt overgebracht in een U-bodem 96 wells plaat met 20 ul van 00,25% trypsine-EDTA. Trypsinize om enkele cellen en over te dragen aan feeders in een vlakke bodem plaat met 96 putjes in 150 ul ESC medium dat dox / VPA of dox alleen. Blijf klonaal uitbreiding van het geïsoleerde IPSC lijnen op feeders in ESC-medium. Verwijder dox en VPA op dag 19 na de toevoeging van (post-transductie dag 23). Gooi IPSC regels die niet te handhaven zelfvernieuwing of proliferatie vergelijkbaar is met ESC controles. Het kan nuttig zijn om uw IPSC regels karakteriseren in relatie tot sociaal-economische raden voordat u probeert om het EG-Verdrag uit te voeren. We hebben gekenmerkt onze lijnen door 1) de expressie van endogene pluripotentie markers (SSEA-1, Oct4, SOX2, nanog) door middel van immunocytochemie, 2) karyotype analyse van chromosoom tellen en 3) embryoid lichaam formatie. Men mag ook lentivirale-specifieke RT-qPCR te bevestigen dat de provirale transgenen niet worden uitgedrukt in de iPSCs. We hebben echter vastgesteld volledig pluripotent iPSCs met alleen morfologie, immunokleuring en karyotyping. In onze experimenten selectie iPSC krommen die ESC-achtige morfologie en groei eigenschappen resulteert in de meeste lijnen expressie pluripotentie markers terwijl we doorgaans vaststellen verschillende lijnen met potentieel abnormale karyotypes. 4. Voorbereiding van iPSCs voor Blastocyst Injectie Passage nummer van een PSC lijn is tot zijn pluripotentie 18 beïnvloeden hoewel dit wel afhankelijk lijn 19. We hebben gebruik gemaakt van iPSCs van passages 8 tot 14 tot volwassen all-IPSC muizen te produceren. Ontdooi iPSCs en plaat op feeders in ESC-medium. Passage de cellen ten minste een keer op feeders vóór gebruik voor injectie. Een putje van een 6-wells plaat met 70-80% confluent iPSCs zal meer dan een voldoende aantal cellen voor injectie. Aspireren groeimedium en was de cellen met ~ 3 ml 1x PBS (zonder Ca2 + / Mg2 +). Voeg 0,5 ml voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA tede cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min met af en toe schudden. Tritureer een enkele celsuspensie te bereiken. Acht cellen door lichtmicroscopie om een ​​enkele celsuspensie te waarborgen. De iPSCs moeten in enkele celsuspensie als kolonies / cel aggregaten zal de injectie pipet verstoppen. Zodra een enkele celsuspensie werd ben bereikt, voeg 1,0 ml ESC media naar de put en de plaat terug naar de 37 ° C incubator. Incubeer gedurende ~ 15 min of tot de meerderheid van de feeders zijn begonnen om zich te houden. Verwijder voorzichtig het medium dat de iPSCs zorg ervoor dat u de zwak hechtende feeders te verwijderen. Plaats de iPSCs in een 15 ml conische buis met 5 ml ESC medium. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant verwijderd en de rest van ES-cel medium met een micropipet. Tik de buis aan de pellet voorzichtig resuspendeer cellen los in 0,2-0,5 ml voorgekoeld FHM medium. Bewaar de cellen op ijs tot en gedurende de injectie in tetraploïde blastocysts. 5. Generatie van Tetraploïde Blastocysten Ingrepen uitgevoerd in dit gedeelte zijn beschreven in detail elders 5,6,20. Hier schetsen we onze techniek, geoptimaliseerd voor de BTX Electro Cell Manipulator ECM 2001. Stel embryo donormuizen door priming 23-28 dagen oude vrouwelijke muizen (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) met PMS en HCG. Dien 5 IU van PMS op veertien en 5 IE HCG 47 uur later. Na HCG injectie, het opzetten van vrouwelijke muizen met C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 stud mannen. Controleer de volgende dag voor vaginale plugs. Euthanaseren aangesloten vrouwelijke muizen en het verzamelen van eileiders. Verzamel 1-cellige embryo's door het plaatsen van eileiders in FHM met hyaluronidase en voorzichtig lostrekken van de ampulae. Laat de cumulus massa's in FHM / Hyaluronidase zitten voor 5-7 minuten. Verzamel 1-cellige embryo's met behulp van een mond pipet en was door middel van druppels FHM media voordat u ze in KSOM-AA cultuur. Kweken bij 37 ° C, 5% CO 2 onder minerale olie 's nachts en selecteer 2-cellige embryo's de dag van elektrolassen, gooit u alle andere embryo's. Plaats een BTX Microslide in een 10 cm Petrischaal. Giet genoeg kamertemperatuur elektrolas media onder te dompelen de dia in de oplossing, maar niet zo veel dat de polen van de elektrode worden volledig ondergedompeld zijn. Schakel ECM 2001 en BTX Enhancer 400. Sluit de ECM kabels aan elektrode van de microslide en bevestig de kabels aan de zijkant van de petrischaal om onbedoelde verplaatsing van de schuif te voorkomen. Uitvoeren van een handmatige puls om een ​​meting op de BTX versterker te krijgen en de spanning van de AC / DC stroom wordt toegepast noteren. AC stroom zal de snelheid waarmee de embryo's af te stemmen tussen de elektroden te controleren, zal gelijkstroom fuseren de blastomeren en pulstijd zal de lengte van de DC-puls in te stellen. Een goed startpunt is AC 3V, DC 100V, en de tijd 0,05 msec. De optimale DC varieert in het bereik van 90 tot 150 volt. </li> Met behulp van een mond Pipetteer ongeveer 30-40 twee-cellige embryo's van KSOM-AA cultuur en was ze door enkele druppels elektrolas medium. Teken verse elektrolasmof media uit de microslide gerecht in de mond pipet en neem embryo's uit de was. Plaats ze in de spleet van 1 mm tussen de elektroden op de microslide. Oppassen dat ze zijn uitgelijnd in het midden van het gat en dat zij niet in contact met elkaar. Breng wisselstroom door het indrukken van de manuele pulsknop. De embryo draait in het wisselveld tot het vlak van blastomeer contact evenwijdig aan de elektroden. Als embryo's niet uitgelijnd in een paar seconden, verhogen AC setting. Na embryo's zijn uitgelijnd, drukt u nogmaals op de manuele puls knop om de DC puls toe te passen. Met elektrolasmof medium in de pipet, het verzamelen van de embryo's van de microslide. Was de embryo's door middel van enkele druppels KSOM-AA en leg ze in KSOM-AA cultuur bij 37 ° C, 5% CO 2. De blastomeer fusie should worden voltooid in minder dan 30 min in cultuur. Herhaal stappen 7-11 voor de resterende 2-cel embryo's. Na de daaropvolgende fusie groepen, te bewaken en te selecteren embryo's met gesmolten blastomeren. Succesvol versmolten embryo's zal blijken te zijn in 1-cellig stadium. Gooi gelyseerd en 2-cellige embryo's na 30 min in cultuur. Als fusie lager is dan 80%, verhoogt de spanning en / of tijd in stappen van 5 V en 0,01 msec. Als lysis is meer dan 20%, verminderen DC spanning en / of tijd dienovereenkomstig. De optimale instellingen in onze experimenten waren AC 4V, DC 146V, en 0,07 msec. Deze instellingen constant leverde 90% of hoger fusie rates met weinig of geen lysis. Blijven cultuur gesmolten embryo in microdruppels van KSOM-AA onder minerale olie bij 37 ° C, 5% CO2. Je zou verwachten dat 85-95% van gesmolten embryo's tetraploïde (4n) blastocysten gevormd na 48 uur incubatie. 6. Micro-injectie van iPSCs in Tetraploïde Blastocysten We maken gebruik van een Nikon TE-2000Uomgekeerde microscoop uitgerust met DIC optiek en Narishige micromanipulators voor blastocyst injectie. Elke tetraploïde blastocyst geïnjecteerd met 10-12 iPSCs een standaard protocol voor ESC injectie in muizen blastocysten waarvan is aangetoond in een eerdere publicatie jove 5,20,21 Plaats een 20 ul druppel FHM in het centrum van een concave objectglaasje en afdekken met 150 pl minerale olie. Laat de holding pipet en micro-injectie naald in de FHM druppel. Laat 2-3 minuten voor beide naalden gedeeltelijk vullen met FHM. Was de 20-30 tetraploïde blastocysten door middel van druppels van FHM en transfer naar de FHM druppel op de microscoop dia. Mondpipet IPSC mengsel in de drop. Het kan nodig zijn de celmengsel verdunnen in een druppel FHM vooraf of cellen te worden geconcentreerd of geaggregeerd. Oppakken 100-200 cellen met de injectienaald. Houd de blastocyst met de binnenste celmassa in de 9 uur ponerenion. Injecteer cellen in blastocoel door het penetreren van de zona pellucida en trofoblast op de 3 uur positie. Injecteer 16 tot 18 cellen per blastocyst. Terug IPSC aangevuld blastocysten naar KSOM-AA cultuur. 7. Overdracht van Aangevuld Tetraploïde Blastocysten naar de baarmoederhoorns van ontvangende muizen Aangevuld tetraploïde blastocysten worden operatief overgebracht naar de baarmoeder hoornen van vrouwelijke ontvangende muizen volgens de richtlijnen van instituut van de onderzoeker, met behulp van de standaard techniek 20 die we kort samenvatten. Selecteer vrouwelijke CD-1 muizen op de pro-oestrus fase en zet ze om te paren met vasectomized mannen. Controleer voor vaginale plugs de volgende ochtend. Vrouwtjes zijn klaar voor de baarmoeder embryo transfer twee dagen na de plug werd ontdekt (2,5 dpc). Een dag voor de ontvanger vrouwtjes gepaard met vasectomized mannen, opgericht extra CD-1 vrouwtjes met niet-vasectomized mannenworden gebruikt als draagmoeders voor-iPSC muizen opgehaald keizersnede. 8. Keizersnede en het bevorderen van de IPSC-afgeleide Pups De overdracht van TC embryo resulteert typisch in meerdere resorptie na de implantatie, zelfs indien de iPSC of ESC lijn een hoog ontwikkelingspotentieel. Dientengevolge kan men verwachten niet meer dan 4 levensvatbare pups (gewoonlijk 1-2) per ontvanger. Deze kleine nesten worden meestal verwaarloosd door de ontvangers. Om het niveau van neonatale zorg en de snelheid van de overlevingskansen te vergroten, voeren we C-profielen en het bevorderen van volgens de standaard protocollen 20. Om de keizersnede uit te voeren, euthanaseren ontvangende muizen 16 dagen na embryo transfer bij 7-twintig (ontvanger 18,5 dpc) en ontleden pups uit de baarmoeder horens. Foster levensvatbare pups naar CD-1 moeders dat de geleverde nesten op dezelfde dag.