检测使用荧光脱氧核酶的细菌

1。化学溶液的制备 0.5米乙烯diaminetetraacetic酸（EDTA）的：在2升（L），塑料烧杯，重量186.1ĞEDTA（电磁学），加灭菌去离子蒸馏水（DDH 2 O）的800毫升（ML）。使用氢氧化钠颗粒（电磁学），调整pH值至8.0。使最终体积至1 L，使用DDH 2 O在4°C，玻璃瓶，反应釜和存储传输解决方案 10×的Tris-硼酸EDTA溶液（10×TBE缓冲;三89毫米，89毫米的硼酸，2 mM的EDTA，pH值7.5）：称取432克三基（BioShop加拿大）和220Ğ，硼酸（BioShop加拿大） ，并添加每个到4升塑料烧杯。衡量80毫升0.5 M的EDTA（pH值8.0），并添加到烧杯中。 DDH 2 O至终体积的4属带有磁性搅拌棒充分混合组件的解决方案，直到完全溶解。在4°C，玻璃瓶，反应釜和存储传输解决方案 10％的变性polyacrylami- 凝胶股票：4 L塑料烧杯，增加1681.7克尿素（BioShop加拿大），400毫升10×TBE缓冲液，1升40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）的解决方案（BioShop加拿大）。调整量与DDH 2 O 4升溶解搅拌尿素。传输解决方案，以1升琥珀色玻璃瓶瓶和储存于4°C。 （Caution!丙烯酰胺应处理手套，口罩，护目镜和白大褂，因为它是一种神经毒素前聚合）。 2×凝胶上样缓冲液（2×GLB）：200毫升玻璃烧杯中，加尿素44克，蔗糖8克（BioShop加拿大），溴酚蓝（BioShop加拿大）10毫克，10毫克xylenecyanol法郎（西格玛-Aldrich公司），400μL10％十二烷基硫酸钠（SDS，BioShop加拿大），10×TBE缓冲和4毫升。调整最终体积至40毫升与DDH 2 O和温和加热（50℃），与磁棒搅拌溶解的固体。转移到1.5毫升离心管和存储1毫升分装在4°C。根据我们的经验，它是在90°C间使用，因为2×GLB的储存条件下巩固之前要热2×GLB简要。 1米的Tris-HCl（pH值7.5）：称取在200毫升玻璃烧杯12.1 Tris碱Ğ。 DDH 2 O的加入60毫升，用磁力搅拌器搅拌溶解固体。使用1 M盐酸（Sigma-Aldrich公司），调整pH值至7.5。弥补体积100毫升DDH 2 O的，并转移到一个玻璃瓶和釜。保存于4°C。 5 M氯化钠：在玻璃烧杯重量58.4氯化钠克（BioShop加拿大），溶于150毫升DDH 2 O DDH 2 O音量调节到200毫升在4°C转移到一个玻璃瓶，高压灭菌器和存储解决方案 DNA洗脱缓冲液：在一个玻璃烧杯，混合2毫升1中号的Tris-盐酸（pH值7.5），8毫升5 M氯化钠和0.4毫升0.5 M的EDTA（pH值8.0）。 DDH 2 O音量调节到200毫升在4°C的高压灭菌器和存储 2×反应缓冲液（2×包肝素钠100毫米，300毫米氯化钠， 氯化镁 30毫米）：50 mL的，猎鹰管（BD猎鹰），添加1.2克肝素钠（BioShop加拿大），0.88克氯化钠和MgCl 2的 0.30Ğ•·6H 2 O （EMD的化学品）和30毫升DDH 2 O混合轻微晃动，直到组件被完全溶解。增加为10 N NaOH溶液调整pH值至7.5 DDH 2 O的调整最终体积至50 mL净化解决方案，使用注射器驱动过滤装置（0.22微米，Millipore公司）和存储在4°C 卢里亚Bertani（LB）肉汤：在一个烧杯中，衡量的LB粉20.0克（Sigma-Aldrich公司），其次是增加1 L DDH 2 O带有磁性搅拌棒充分混合溶液，溶液转移至锥形瓶中。釜在室温下的解决方案和存储。 1.5％LB琼脂：取250 mL三角瓶中，琼脂1.5克（BioShop加拿大），并添加100毫升的液体LB。釜混合物在室温和存储。 琼脂电镀：梅尔T的微波炉在LB琼脂和冷静的解决方案〜50°C。倒到培养皿下的火焰（Fisher Scientific则）的解决方案。根据我们的经验，可以产生100毫升LB琼脂5-6板。 2。 RFD的-EC1的模板RFSS1建设导酶法结扎 RFD的EC1的（ 图2A），是功能的核酶。它由催化序列EC1的FS1的底物序列（ 图2A中的黑色和绿色的线条表示）。 RFSS1（ 图2A）是一个RFD的-EC1的炒版本的催化序列EC1的部分洗牌到高中，但FS1的部分保持不变。 RFD的-EC1的和RFSS1作了模板介导的寡核苷酸FS1的酶结扎作为结扎模板存在的LT1 EC1的寡核苷酸或高中（见插入盒中图2A）。下面提供的程序进行连接反应。在耶鲁大学获得FS1的凯克寡糖合成设施，地deprotected和凝胶电泳纯化后，先前成立的协议。17-24 EC1的，SS1和LT1购买集成DNA技术和凝胶电泳纯化。 准备100微米的FS1的，EC1的，SS1和LT1原液使用DDH 2 O储存在-20°C，直到他们使用。 5μLFS1的储备液转移到两个1.5μL离心管1和管2标管。每管中，加入38.5μLDDH 2，然后5μL10×T4多核苷酸激酶（PNK）反应缓冲（MBI的Fermentas公司），其中包含500毫米的Tris-HCl（pH值7.6，25℃），100毫米MgCl 2的数码地面电视，50毫米，1.0毫米的精。混合每一个解决方案，通过吸取（吸取的解决方案上下了几次）。 加入1μLATP（100毫米; MBI的Fermentas公司）和混合吹打。 加入0.5μLT4多核苷酸激酶（PNK细胞; 10个/μL，MBI的Fermentas公司）和吹打混合。反应混合物在37℃孵育30分钟。确保覆盖铝箔管，以减少光漂白的荧光。 快速反应在90°C加热5分钟。反应混合物在室温冷却10分钟。 加入5μLEC1的高中原液管1和管2，分别。 添加到每个管，混合吸取5μL的LT1股票方案。反应混合物在90℃加热1分钟，冷却到室温10分钟。 加入118μLDDH 2 20μL10×T4 DNA连接酶缓冲液（MBI Fermentas公司），其中包含400毫米的Tris-HCl（pH值7.8在25°C），MgCl 2的 100毫米，100毫米的DTT，5 mM的ATP的。吹打混合的解决方案。 添加2μLT4 DNA连接酶（5个/μL，MBI的Fermentas公司），并吹打混合。反应混合物在室温孵育1小时。 加入20μL的3个M醋酸钠（pH值7.0），以每管，旋涡和自旋向下。每管加入500μL100％冷乙醇，混合解决方案，并通过涡旋管在-20°C冰箱放置30分钟。 离心20分钟的混合物在11000Ğ在4°C的冷冻离心机（Allegra的X22的-R Beckman Coulter公司），并小心地取出，吸取上清液。 使用的DNA集中的Thermo Scientific）（萨文特的DNA Speed​​Vac离心10分钟，干燥DNA沉淀。 在30μL1×凝胶负载缓冲液（GLB），短暂涡旋重悬DNA颗粒和自旋向下的台式离心机（Minicentrifuge，厂商VWR科学）。结扎的DNA样本是在装上10％dPAGE凝胶准备。 3。 10％dPAGE凝胶的制备以下步骤简要介绍了凝胶电泳装置及其设置。对于有关的器具，设置和处理更大的详情，请参阅ţ30,31 o我们先前公布的协议。 洗净并擦干玻璃板，两个0.75毫米的间隔和16以及梳。组装与剪辑的玻璃板和垫片水平打下一个缺口玻璃板朝上的平坦表面上。 转移到150 mL烧杯40毫升10％dPAGE组合。用移液器纷飞，加入40μL的四甲基乙二胺（TEMED; Bioshop部）400μL10％的APS，拌匀。 仔细倒入混合物板之间，并立即插入梳子。让混合物聚合为10至20分钟。可以确认检查烧杯中留下的残余凝胶混合聚合。 聚合后，取出梳子轻轻地与DDH 2 O冲洗井井，以消除残胶溶液。 板和安装到与凝胶电泳仪的无缺口的矩形板朝外放置一个缺口板背后的金属板。使用金​​属PL吃有助于防止经济过热，可以破解玻璃板。 加入1×TBE缓冲仪器的上限和下限商会。检查，以确保井充满了缓冲区和凝胶下缘沉浸在缓冲区。 申请一个40毫安的电流和（或750伏）预运行10至15分钟。 4。 10的％dPAGE凝胶净化结扎RFD的EC1的和RFSS1 继3.7步，1×TBE缓冲液使用的注射器和针头冲洗井。 装入2井使用移液器和的凝胶加载提示（Diamed）（每一个）的RFD的EC1的和RFSS1结扎混合物（2.13）。适用于40毫安（750伏），电流，直到底部的染料（溴酚蓝）板的底边上方约5厘米。 从玻璃板的凝胶运行装置，在平坦的台式躺下，小心取出垫片。 小心取出从凝胶顶部玻璃板（尽量避免凝胶包裹的皱纹和折叠）用保鲜膜包裹的凝胶。 结扎的产品无论是可视化可以作为一个标记，用紫外线遮蔽（260纳米）或透射（360 nm）的EC1的或高中（100 pmol EC1的或高中以上几厘米，这将产生一个可见的DNA条带和到4.2的步骤以及加载）。标记标记所需的DNA条带。 海关用无菌刀片的DNA条带，切成小块，然后转移到一个新的1.5 mL离心管中的凝胶。 粉碎的离心管内的凝胶块，用无菌枪头（200μL针尖大小）。 每管加入500μLDNA洗脱缓冲和覆盖铝箔，避免光线的荧光。涡旋样品10分钟。 在11000Ğ离心4分钟，在4℃中冷冻离心机（Allegra的X22的-R的，贝克曼）样品，仔细转移350μL的Supernatant到一个新的1.5 ml离心管（如果需要的话，第二次洗脱可以与新鲜洗脱缓冲液350μL，再过10分钟）。 每管加入3 M醋酸钠（醋酸钠，pH值7.0）35μL（样本量的0.1倍），涡旋结构和自旋向下。每管900 UL 100％冷乙醇。混合每个样品的手颤抖了几秒钟，管。管在-20℃放置至少1小时。 离心11,000Ğ样本为20分钟，4°Ç在冷冻离心机，并小心地取出，吸取上清液。 加入100μL70％冷乙醇，并用它来轻轻冲洗整个管内壁。离心机在11000Ğ7分钟，在4°C取出上清液，干燥的颗粒，用10分钟的DNA集中。 溶解于100μL的DDH 2 O和旋涡的DNA颗粒。确定DNA浓度的基础上，在260 nm处的紫外吸收。商店样品在-20°C，直到使用。 5。细菌的制备目标菌株E.大肠杆菌 K12（MG1655）和相关的控制株首先从甘油的LB琼脂平板上镀。下一个火焰，或在生物安全柜，触摸无菌枪头轻轻连败到钢板表面，以避免损坏LB琼脂细菌甘油股票。 反向条纹板在37°C孵育14小时。孵化后，密封封口膜（佩希内塑料包装）和存储在4°C的整个周边板块这些板块可以存储最多为4周。 6。原油外混合物制备（CEMS） 免除的LB 2毫升到14毫升无菌培养管，用移液枪（康宁）（屋宇署猎鹰）。 使用无菌枪头，从5.2步准备琼脂平板中挑一个单一的殖民地，并插入ACulture管。在孵化的地方（新不伦瑞克省科学）管设置在37°C，14小时在250转摇。 1％，再接种培养：取14毫升培养管和穗成20步骤6.2准备细菌培养液2毫升新鲜LB。在37°C孵育管在250转摇，直到每个细菌的解决方案达到的外径约1 600（在600 nm的光密度测量）。外径600来衡量，转移1毫升每一种文化的一次性试管和600 nm的紫外分光光度仪（Thermo Scientific的紫外线10，Genesys的）测量吸光度。 转让在11000Ğ离心1毫升每一种文化的一个新的1.5毫升离心管和颗粒细胞在室温下5分钟。 上清转移到一个新的1.5 ml离心管和储存在-20°C，如果不立即使用。 7。检测使用荧光分光光度计打开荧光分光光度计（CARY Eclipse中，瓦里安公司），并建立与激发在488 nm和520 nm处的发射数据采集参数。读数可以采取每分钟为1小时。 DDH 2 O的 100％乙醇，洗3石英晶体试管（瓦里安卡里）。闪烁氮气干燥的试管。标签试管C1（对照1），C2（控制）和T（测试）。 转移24μLDDH 2 O的 C1和C2和T.加入25μL2×包到每个试管和地点在荧光分光光度计24μL的CEM-EC。开始收集的第一个5分钟的荧光数据。 1μL的RFSS1，（从5微米原液），C2和1μLRFD的-EC1的T和C1（从5微米原液）。混合吸取每个解决方案。这必须仔细启动，使荧光读数不被中断。使反应继续下去，休息1小时采集时间。 保存在Excel文件格式的数据，将数据传输到个人电脑和处理数据，以创建一个图形图像。 8。凝胶电泳检测步骤7.4准备同样的反应混合物，可用于凝胶电泳分析，或者新的反应同样可以准备和培养在1.5毫升离心管。在这两种情况下： 急冷反应1小时后，加入5μL3个M醋酸钠和100％的乙醇125μL。混合涡旋每个解决方案，并将其放置在-20°C冰箱1小时管。 反应混合物离心20分钟11,000Ğ在4°C和吸取上清液小心取出。 干燥的颗粒，用10分钟的DNA集中。 重悬浮颗粒，在20μL1×GLB简要涡旋。降速管很简单的台式离心机（Minicentrifuge，厂商VWR科学）。这些样本读y为装载成dPAGE凝胶。 准备在3.1-3.7所述的10％dPAGE凝胶。装入井用移液器和凝胶装载提示（Diamed）的反应样品（步骤8.4）。适用于40毫安（750伏），电流，直到底部的染料（溴酚蓝）板的底边上方约5厘米。 卸下玻璃板，用自来水彻底清洗，以消除任何凝胶件。擦板与kimwipe（金佰利专业）。 扫描使用台风扫描仪（9200台风，可变模式，GE医疗集团）荧光的凝胶板。使用ImageQuant软件（分子动力学）分析数据。 9。检测的特异性为测试细菌的特异性，同样的上述程序培养大肠杆菌大肠杆菌 ，准备CEM和进行裂解反应检测可以执行B.不同菌株，如枯草芽孢杆菌，P. peli，Y. ruckeri，L. P级lanturum，P.球菌（ 图3A所示）。 10。单细胞检测准备一个1毫升E.大肠杆菌 2 CFU /毫升（cfu：菌落形成单位）连续稀释的甘油和菌落形成单位的浓度由镀确认该股票应包含0.2 CFU/100μL的。贮存于-80°C，直到使用。 准备10含2毫升的LB培养管。 接种震动250转100μL2 CFU / mL的甘油库存，并培育每一种文化，在37°C。整个甘油的使用（1毫升）应产生10个文化。 每个接种的培养管在下面的时间点：4，8，12，16和24 h收获300μL。留下余下文化成长为24小时。 测量外径600和沉淀的细胞，离心5分钟在11000Ğ。 新鲜的1.5 ml离心管，并储存在-20＆D转移的CEMS例如，直到使用C。 注：因为可能有收获时间4点，8日和12样品没有检测到OD 600，让余下的文化增长为24小时，以确定含有细菌浊度和外径测量确定的文化。只有一个或两个10文化可能包含大肠杆菌接种后的大肠杆菌和剩余管将不包含任何细胞。 使用从积极的文化，在指定的时间点（储存在-20°C）的CEMS恢复到准备与RFD的EC1的裂解反应，然后在第8节所述使用dPAGE凝胶电泳分析反应混合物。 11。概念和代表结果利用的RNA裂解荧光脱氧核酶（RFD）的细菌检测的概念图所示。 1。 RFD的克里弗斯嵌合在一个孤独的RNA联动（蓝色）的DNA / RNA底物，两侧是两个标记的核苷酸用荧光（F）和猝灭（Q）的，分别。由于利益的细菌（如大肠杆菌 ）在媒体的增长，它会留下原油外混合物（CEM）。 CEM是作为一个整体，然后在体外筛选实验中获得RFD的，特别是响应的CEM;想必RFD的一个特定的分子，这是一个细菌的签名分子的CEM（紫色星）交互。当CEM是添加到反应液中含有的RFD，它触发的RFD的RNA裂解活性。卵裂事件分离从Q楼的荧光信号，可以检测使用荧光计或凝胶电泳。 实验验证了上述概念进行大肠杆菌的CEM 大肠杆菌 （CEM – EC）。我们获得了3 RFD的分子通过体外筛选 ，最有效的一个指定RFD的EC1的（ 图2A）5 Wé在CEM – EC测试RFD的-EC1的裂解活性（以及名为RFSS1的突变序列）。酶核酶部分结扎FS1的基板（所有序列见图2A），都RFD的EC1的和RFSS1准备。在荧光测量实验（ 图2B），CEM – EC孵育仅5分钟，随后的RFD的EC1的或RFSS1此外，进一步潜伏期为55多分钟。溶液的荧光强度不断读取每分钟的数据被用来计算相对荧光（射频;在时间t的比率荧光强度与荧光强度在时间0计算）。与孵化时间的RF值绘制成图。 2B。它被发现，RFD的EC1的产生高水平的荧光信号后，CEM – EC此外，与之形成鲜明对比的是，RFSS1没有产生强烈的荧光信号。因此，荧光产富RFD的-EC1的nction是在接触CEM – 欧共体特定序列。 为了验证，观察荧光的增加是由于裂解RNA的联动，我们分析了反应混合物由dPAGE。 RFD的-EC1的卵裂预计将产生两个DNA片段，5'片段和3'，保留的荧光片段保留淬灭。只uncleaved RFD的EC1（unclv）的5'片段（CLV）可以通过荧光成像检测。 dPAGE结果如图。 2C显示，RFD的EC1的和CEM – EC反应混合物确实产生预期的分解产物，而没有RFSS1/CEM-EC混合物。 RFD的-EC1的特异性检查使用从其他几个革兰阴性和革兰氏阳性菌和收集的数据显示在图的商业电子讯息。 3A。只有样品含有CEM – EC（蓝色曲线）产生荧光的增加。缺乏与商业电子讯息的交叉反应从其他细菌中表示，RFD的EC1的是高度选择性的大肠杆菌大肠杆菌 。 我们还研究了一个单一的大肠杆菌培养所需的时间为了产生足够的CEM可以诱导卵裂的RFD的EC1的大肠杆菌细胞。在这个实验中， 大肠杆菌包含定义CFU（菌落形成单位）的大肠杆菌样本被充分稀释，以实现1 CFU / mL的浓度。其次是混合100μL稀释后的细菌样本的培养基和培养它，4，8，12，16和24 h。商业电子讯息，然后收集每个时间点和诱导RFD的-EC1的切割活性测试。 dPAGE结果如图。 3B表明，需要一个12小时的培养时间。 重要的是要注意CEM – EC的RFSS1序列（阴性对照）除了最初的小信号增加后观察荧光测量（ 图2B，红色CURV，E）或RFD EC1的其他细菌商业电子讯息（ 图3B;除蓝色以外的所有曲线）归因于的FRQ模块的固有荧光（由于不完全淬火按Q F）。因此，预计增加的F-和Q-标记的序列会产生一个初始的荧光增加。然而，只有RFD-EC1/CEM-EC的混合物能够产生高水平的荧光随着时间的推移。 图1的RNA裂解荧光脱氧核酶（RFD）的探头示意图原油外感兴趣的特定细菌细胞产生的混合物（CEM）的接触后发出荧光。 RFD的切割嵌合在一个孤独的RNA联动（蓝色）的DNA / RNA底物1（F）的荧光猝灭（Q）分别标记两个核苷酸两侧。裂解反应之前，荧光水平的RFD是最小的密切PROX切割后的F和Q imity，问从F出发，作为一个结果，产生强烈的荧光信号。 图2。的E.大肠杆菌检测RFD的。 （一）RFD的EC1的是，可以通过CEM – EC激活核酶探针。 RFSS1是炒一个RFD的-EC1的序列作为对照。 RFD的-EC1的和RFSS1结扎FS1的EC1的和SS1，分别作为模板存在的LT1，生产。传真：荧光修饰的脱氧胸苷。问：DABCYL修饰的脱氧胸苷。记：腺嘌呤核苷酸。 （二）荧光信号中存在的CEM-EC RFD的-EC1的和RFSS1型材。 （三）在B的裂解反应混合物dPAGE分析（反应时间：60分钟）。图为台风扫描器获得的dPAGE凝胶的荧光图像。弄数控：RFD的EC1的或仅在反应缓冲RFSS1;：巷CEM – EC：RFD的-EC1的反应缓冲区包含CEM – EC RFSS1。标记RFD的-CE1的0.25 N的NaOH，已知造成的RNA裂解的过程处理。 unclv：uncleaved RFD的EC1的。 CLV：裂解片段含有荧光。 图3。（一）荧光信号RFD的-EC1的个人资料，准备从各种细菌细胞的商业电子讯息。欧共体： 大肠埃希氏大肠杆菌 K12的PP：peli假单胞菌BD：Brevundimonas的diminuta;医管局： 铪alvei里亚尔;：ruckeri耶尔森 ;保留所有权利。：grignonese Ochrobactrum; AX的木糖氧化无色杆菌 ;莫：osloensis莫拉，AI：lwoffi鲍曼不动;科幻： 沙雷氏菌fonticola; BS： 枯草芽孢杆菌 ;马莫里尼： 明串珠菌肠膜 ;低压：planturum乳酸菌 ，PA： 乳酸片球菌 ;敖： 放线菌侧柏 。每个CEM的样品孵育5分钟，随后RFD的-EC1的。 （二）dPAGE经过60分钟的反应RFD-EC1/CEM-EC混合物的分析。弄一次国家信息通报：在单独的反应缓冲RFD的EC1的。里第二次国家信息通报：RFD的EC1的反应中含有CEM – BS（ 枯草芽孢杆菌制备的CEM）的缓冲区。 RFD的EC1的在含CEM – EC反应缓冲区从一个单一的大肠杆菌的细菌含有文化的标示：4，8，12，16和24车道大肠杆菌细胞后生长期为4，8，12，16和24 h分别。