Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

1. Cerrahi Prosedür Set-Up Notlar Ameliyat öncesinde cerrahi malzemeleri ve aletleri sterilize edin. Her bir sıçan için steril cerrahi işlem için kullanılan Malzemeleri araçların yerleştirilmesi için steril bir yüzey olarak dışarı yerleştirebilinirler 1 drape dahil, merkezi x 1.5 0.5 hakkında önceden kesilmiş delikli bir drape sıçan üzerine yerleştirilecek ve gazlı bez. Esnasında, önceden kesilmiş delik sıçan üzerinde yapılan bir kesi ile uyumlu hale getirecektir. Ameliyat için gerekli Aletleri dikiş malzemesi kesmek için kullanılacak makas 1 standart çift, iki forseps ve sütür taşınması ve kavrama için ince bir iğne tutucu ve bir bıçak ile bir neşter vardır. Biz Özel Cerrahi Malzemeler ve Araçlar Tablo bizim laboratuar tarafından kullanılan ortak araçları listeledik. Ancak, nihai aracı seçim deneyci tercihlerine bağlıdır. Cerrahi alan hazırlayın. Sağlamak için bir ısıtma yastık altında bir 100 ml% 0.9 steril tuzlu su torbası koyun o kişi w gelir tuzluITH mezenter dokusunun yaklaşık 37 için önceden ısıtılır ° C Salin bir alternatif olarak, Ringer çözeltisi ya da başka bir fizyolojik tampon kullanabilir. Eksteriorizasyon işlemi sırasında kolay erişim için steril bir örtü üzerine steril cerrahi aletler ve malzemeleri yerleştirin. Ayrıca, steril pamuk uçlu aplikatörler ve sütürlerin uygun 3 tip (4-0, 5-0 ve 7-0) ihtiyacınız olacaktır. Emin paketleri malzemeleri steril taşıma ile erişilebilir, böylece önceden açılmış yapar. Son olarak, en az 5 dakika için% 100 etanol içinde daldırarak pre-değiştirilmiş plastik aşaması dezenfekte. Aşamada merkezi (Şekil 1) kesilmiş bir eliptik delik olan bir 100 mm Petri yemektir. A Dremel Aracı başlangıçta yapmak ve, gerektiği takdirde, deliğin genişletmek için kullanılabilir. Deliği yapıldıktan sonra, kesme plastik kenarları farklı tanelerinin zımpara kağıdı kullanılarak düzgün yapılır. Sahne sonra ya etkisiz kil modelleme (yerel el sanatları mağaza satın alınan) veya Silic, nihayet, yıkanmış ve birTutkal yükseltilmiş bir düz yüzey temin etmek için delik kenarına eklenir. Doku ile temas öncesinde, sahne yeterince steril tuzlu su ile durulanmalıdır gerekecektir. Anjiyogenez bu model için, biz genellikle erişkin erkek Wistar sıçanlar (350 ± 25 gr) kullanın. Diğer sıçan suşlara ve yaş kullanılabilir. Laboratuvarımızda, sıçanlar ketamin (80 mg / kg), ksilazin (8 mg / kg) ve atropin (0.08 mg / kg) ile intramüsküler enjeksiyon yoluyla anestezi uygulanmıştır. Yaklaşık 5 dakika sonra, anestezinin etkisi onaylanır ve farenin karın cildi tıraş edilir. 2. Sıçan mezenter eksteriorizasyon Modeli Vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerinde sırtında anestezi sıçan yerleştirin. Aseptik teknikler cerrahi işlem sırasında kullanılan. Steril eldiven giyin ve araç ve gereçlerin sıçan dokuları dışında steril olmayan yüzeylere temas etmesine izin vermeyin. Mendil USI alternatif karın alanı temizleyinng% 70 izopropil ve iyot ile ıslatılmış steril gazlı bez. Bisturi bıçak kullanılarak, cilt üzerinde küçük (yaklaşık 0,75 inç) uzunlamasına kesik ve sonra aşağıda sternum linea alba yaklaşık 1 inç edin. Açıklığı kesi aynı hizada olacak şekilde karın bölümünün üzerine önceden kesilmiş drape yerleştirin. Yavaşça kesi çevresinde basınç uygulayın. Bu genellikle kolayca tespit edilmesi için yeterince ince bağırsakta ortaya çıkmasına sebep olacaktır. Pamuk uçlu aplikatör kullanarak, yavaşça ince bağırsağın bir bölümü çekin ve ileum bulun. Mezenter çekilirse gibi, yavaşça plastik aşamada (Şekil 2) dışarı yerleştirebilinirler gerekir. 6-8 vaskülarize mezenterik pencereleri belirleyin. A mesenterik penceresi ince bağırsağın (Şekil 2) besleme arter / ven çiftleri arasındaki ince geçirgen zar olarak tanımlanır. Eksteriorizasyon başlangıç ​​zamanı kaydedin. Mesente bırakınry bölüm 20 dakika batın. Eksteriorizasyon dönemde aralıklı doku batırma kalır ve kurumasına değil emin olmak için Petri kabındaki tuzlu su doldurmak için steril bir enjektör (5 ml) kullanın. 20 dakikalık süresi boyunca, steril 7-0 sütür ile 2 merkezi mezenterik pencereleri işaretleyin. Işaretleri bağırsağın yakın yağ alanında yapılmalıdır. Karın boşluğuna mezenter batın bölgesi dönün. Kesintiye desen 5-0 monofilament sütür ile karın kas kapatın. Kesintiye desen 4-0 monofilament sütür ile cilt kapatın. % 70 isopropoyl ve iyot ile ıslatılmış steril gazlı bez mendil kullanarak alternatif ile sütüre alanı silin. Sıçan her iki göz de göz kayganlaştırıcı jel sürün. Göz kayganlaştırma amacı, cerrahi işlem sırasında ve geri kazanım kornea kurumaya önlemektir. Göz yağlayıcı uygulama uygulanmalıdırcerrahi müdahale başlamadan önce. Gerekirse, kurtarma için kendi kafesine sıçan dönmeden önce göz yağ yeniden uygulayın. 3. Doku Hasat ve Fiksasyon Ilgi sonrası stimülasyon gününde, uyutmak ve sıçan euthanize. Laboratuvarımızda, fareler beuthanasia intrakardiak ile ötenazi ardından intramuskuler ketamin (80 mg / kg), ksilazin (8 mg / kg) ve atropin (0.8 mg / kg) ile enjeksiyon ve üzeri anestezi vardır. Beuthanasia hızlı ve ağrısız ötenazi için kullanılabilecek bir sodyum pentobarbital / fenitoin çözümdür. 0.2 ml – sıçan başına laboratuvar genelde 0.1 enjekte eder. Karın boşluğuna yeniden açın ve yavaşça ince bağırsak kaldırmak ve iki işaretli pencere bulun. Forseps ve mikro-makas kullanarak batın mezenterik pencereleri her kesin. Yağ başına pencerenin bir sınır da dahil olmak üzere daha sonraki dokusu mikroskop lamı üzerine yaymak için avantajlıdır. HemenPBS her pencere batırmayın. Keserken, pencerelerin dolum potansiyel kan aza indirmek için pencere yağ sınırları içinde arter / ven çiftleri ile kesme kaçınıyorum. Ayrıca, bağırsak içeriği sonuç pencereleri temas ettiği barsak ile kesme aza indirmek. Pozitif yüklü mikroskop lamı üzerine dokulara yayılmasına forseps kullanın. İki dokular slayt başına monte edilebilir. Dokuların kısmen kurutun ve bir neşter bıçağı aşırı şişman kaldırmak kullanarak izin verin. Dokular artık sabit hazırız. Tipik fiksasyon yöntemleri kullanılabilir. Laboratuarımızda, biz genellikle 30 dakika boyunca metanol (-20 ° C) slaytlar düzeltmek. Başarılı etiketleme da sabitlenmemiş dokuları ile yapılmıştır. Tespit yöntemlerinin tercih edilen antikor bağlı olabilir. 4. Doku ile immün Dokular genel şimdi immünhistokimya için antikor başına talimatlarına göre etiketli olabilir. Rolleri belirlemek bizim ilgi göz önüne alındığındaanjiyogenez sırasında damar perisitler, bizim laboratuar yaygın endotel ve perivasküler hücreleri 10, 12, 13 için etiketler. Mikrovasküler ağların hiyerarşisi boyunca endotel hücreleri tanımlamak için yararlıdır etiketlerin, bir anti-PECAM antikor veya BSI-lektin vardır. Bu doku kullanılan perivasküler hücre işaretleyicileri NG2, desmin SM-α aktin, PDFGRβ ve sınıf III β-tubulin içerir. Aşağıda, bölüm 3.3 'de, biz kolorimetrik ve floresan PECAM immün protokolleri protokolleri listeledik. İlk primer antikor inkübasyon öncesi, kaydıraklar aşırı tampon çözeltisi kaldırmak için vakumda kurutulur vardır. Ayrıca, dokular, başlangıçta uzağa dokudan antikor çözeltileri kontrolsüz akışını önlemek için bir balmumu kalem ile açıklanmaktadır. Son olarak, tüm etiketleme adımları yıkama adımları takip ediyor. Adımları yıkama için, slaytlar boyama kavanoz içine yerleştirilir. Tampon çözelti yıkama süresi sırasında 3 kez değiştirilir. Endotel hücre antikor etiketleme prosedürleri: <p class = "jove_step"> PECAM Kolorimetrik Lableing Primer antikor inkübasyon: Her doku üstünde yaklaşık 100-200 ml primer antikor çözeltisi (antikor tampon içinde seyreltilmiş 1:200 fare biyotinile CD31 monoklonal antikor (PBS +% 2 BSA% 0.1 Saponin)) Damla; bütün doku olduğundan emin olun antikor çözeltisi ile kaplanmıştır. Oda sıcaklığında 1 saat için inkübasyon. 30 dakika süreyle PBS +0.1% saponin ile dokuları yıkayın. İkincil antikor inkübasyon: Damla sekonder antikor çözeltisi (Vector Laboratories VECTASTAIN Elit ABC çözümü; bir streptavidin peroksidaz sekonder antikor çözeltisi) doku üstünde. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edilir. 30 dakika süreyle PBS +0.1% saponin ile dokuları yıkayın. 15 dakika boyunca vektör Nova Kırmızı ile dokuları inkübe edin. Sonra su ile dokulara yükselecek. Dağı slaytlar:% 95 etanol Dip slaytlar 10 kez. Immerse 2 dakika için% 100 etanol içinde kayar. Başka bir% 100 etanol içinde bırakın slaytlar yüzden2 dakika için Direkt Ekspres. Ardından 2 dakika arayla üst üste% 100 ksilen çözümler batırmayın slaytlar. VectaMount ince bir tabaka ve bir coverslip ile dokuları kurutmak ve kapatmak için izin ver. PECAM Floresan Etiketleme Primer antikor inkübasyon: Her doku üstünde yaklaşık 100-200 ml primer antikor çözeltisi (antikor tampon içinde seyreltilmiş 1:200 fare biyotinile CD31 monoklonal antikor (PBS +% 2 BSA% 0.1 Saponin)) Damla; bütün doku olduğundan emin olun antikor çözeltisi ile kaplanmıştır. Oda sıcaklığında 1 saat için inkübasyon. 30 dakika süreyle PBS +0.1% saponin ile dokuları yıkayın. Sekonder antikor inkübasyon:. Doku üstüne Damla sekonder antikor çözeltisi ((1:100 Streptavidin-Cy3 (PBS +% 2 BSA ile% 0.1 Saponin) antikoru tamponu içinde seyreltilir) 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe. 30 dakika süreyle PBS +0.1% saponin ile dokuları yıkayın. Dağı slaytlar: dokuların üst gliserol 50:50 PBS Damla. Kapakkapak kayma ile. Sonra, kapak kayma ve slayt arasındaki boşluğu kapamak için tırnak cilası kullanabilirsiniz. 5.. Temsilcisi Sonuçlar Immünohistokimyasal PECAM için etiketli sıçan mezenter dokuların Temsilcisi görüntüleri Şekil 3 görüntülenir. PECAM etiketleme mikrovasküler ağlar remodeling hiyerarşisi boyunca damar türleri tanımlar ve spesifik zaman noktalarında sonrası uyarılması azından anjiyojenik ölçümlerini ölçmek için kullanılabilir. PECAM etiketleme da damarları karşı venüller belirlenmesi için olanak sağlar. Besleme arteriyollerde genellikle eşleştirilmiş venüller (Şekil 4) göre daha küçük çaplarda ve uzamış endotel hücre morfolojisi gösterirler. Kılcal ve kılcal damar filizi kendi çapına ve bir şebeke dahilindeki göreli konumu göre tespit edilebilir. Remodeling ağlar tipik özellikleri arttı filizlenmesi kılcal damar yoğunluğu, damarlı bölge ve venular kıvrımlı dahilSığ. Çeşitli anjiogenik ölçümleri Kantitasyonu ağ büyüme (Şekil 5) zamanında ders tanımlar. Gün 3 ve 5. Gün ve Gün 10 unstimulated seviyeye getirileri arasında önceden var olan gemiler, tepelerinden filizlenme Kapiller. Küba'da Bu geçici bir artış damar yoğunluğu ve damarlı bölge artışlar takip eder. Bu modelde büyük damarların yeniden kanıt olarak, arteriol ve venül segment sayısı da zaman boyunca artar. Laboratuvarımızda, bu model Bu yenilenme sürecinde 10, 11 sırasında belirli bir zaman noktasında hücresel fenotipik değişiklikleri tanımlamak için kullanılmaktadır. Örneğin, sınıf III β-tubulin anjiyogenik damarlar boyunca perisitler (Şekil 6) tanımlar. Unstimulated dokularda, sınıf III β-tubulin ifadesi sinir özgüdür. Bunun aksine, filizlenme kılcal tepe boyunca, sınıf III β-tübülin perivasküler hücreler olarak ifade edilir. Bu türsonucu anjiyo sürecine dahil yeni hücre tipleri tanımlamak için bu basit ve sağlam anjiyogenik modelinin kullanımını vurgulamaktadır. Şekil 1. Plastik sahne öncesi ve sonrası modifikasyon Görüntüler. Önceden modifiye aşamasında 100 mm Petri yemektir. Değişiklikler merkezinde elips şeklinde bir delik kesim ve kabarık, düzgün bir yüzey yaratmak için deliğin kenarına modelleme kil veya silikon tutkal sonradan eklenmiş. Bu yüzey batın mezenterik pencerelerin superfusion kolaylaştıran bir iç sınır sağlar. Ölçek çubuğu 1 cm. Şekil 2. Batın mezenterik bölgenin görüntüsü. Mezenterik pencereler ince bağırsağın besleyen arter / ven çiftleri arasındaki ince geçirgen membranların olarak tanımlanır. Eksteriorizasyon sırasındasüresi, mezenterik bölgede ortaya koydu ve bir modifiye petri içinde tuzlu batırılır. İnert sarı kil modelleme önceden kesilmiş delikten çekilebilecek şekilde mezenter için pürüzsüz bir yüzey sağlar. Ölçek çubuğu 1 cm. Şekil 3. Unstimulated doku ve doku 3 ve mezenter 10 gün sonrası eksteriorizasyon gelen mezenterik mikrovasküler ağların Temsilcisi görüntüler. PECAM etiketleme arteriyoller (A), venüller (V) ve kılcal (C) de dahil olmak üzere mikrovasküler ağların hiyerarşisi tanımlanır. Mesaj stimülasyon, mikrovasküler ağlar kılcal çimlenme (ok başları) ve damar yoğunluğunda bir artış göstermiştir. Ölçek çubuğu 100 mikron olduğunu. Erişkin sıçan mezenterik mikrovasküler ağ içinde arteriyol / venül çiftleri Şekil 4. Temsilcisi görüntüleris. Her iki görüntüleri, arteriol (A) daha küçük bir göreceli çap ve uzamış endotel hücre morfolojisi dayalı venüller (V) ayırt edilebilir. Ölçek çubukları 20 mm'dir. Şekil 5. Mikrovasküler büyüme sonrası mezenter eksteriorizasyon zaman boyunca anjiyogenik ölçümlerini Temsilcisi miktar. Doku alanı başına A) Vasküler alanı. Vasküler alana düşen kılcal filizi B) sayısı. Vasküler alan başına C) Toplam damar uzunluğu. * Unstimulated grubuna göre anlamlı bir farklılık gösterir. İstatistiksel karşılaştırmalar Dunn testi tarafından izlenen bir One-Way ANOVA kullanılarak yapılmıştır. (P <0.05). UN unstimulated temsil eder. Şekil 6. 3 ve 10 unstimulated doku ve dokulardan mezenterik mikrovasküler ağların Temsilcisi floresan görüntülerigün mezenter dışsallaştırdığını gönderin. Immünofloresan PECAM etiketleme (kırmızı) endotel hücreleri tanımlayan ve sınıf III β-tubulin etiketleme (yeşil) sinirler (ok başları) ve perivasküler hücreleri (oklar) tanımlar. Perivasküler hücreler geçici çimlenme kılcal sırasında sınıf III β-tubulin upregulate. Unstimulated mikrovasküler ağlarda, sınıf III β-tubulin sinir özeldir ve perivasküler hücreleri belirlemek değil. 3 gün sonrası stimülasyon, sınıf III β-tubulin olumlu mikrodamarlar birlikte perivasküler hücreler etiketler. Günlük 10, sınıf III β-tubulin ifade desen unstimulated senaryoyu geri dönmeye başlarlar. Ölçek çubuğu 50 mikron olduğunu. Şekil 7. Mezenter eksteriorizasyon tarafından uyarılan mikrovasküler ağ büyüme sırasında izleme önceden etiketli lokal olarak uygulanan hücre fizibilite destekleyen Görüntüler. Hücreler Mezenter üzerinde superfused edildi20 dakikalık eksteriorizasyon döneminde ic pencereler. 1 gün sonrası cerrahi, DII etiketli hücreleri (kırmızı) PECAM pozitif mikrodamarlar (yeşil) ile dame odak düzlemi gözlendi. DII etiketli kemik iliği hücrelerinin A, B) Örnekler morfolojileri yuvarlak ve uzamış sergilenmesi. Bazı durumlarda (oklar) hücreleri kılcal boyunca uzamıştı. C) DII bir küme Örneği (ok) filiz kılcal bir ucu yakınında mezenkimal kök hücreleri etiketli. Ölçek çubukları 50 um (A) ve 20 um (B, C) vardır.