Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

1. Isolatie van myeloïde cellen uit TRAMP prostaattumoren Alle procedures werden uitgevoerd onder leiding van een dier Review Board. TRAMP muizen ontwikkelen spontaan inheemse prostaatkanker als gevolg van een transgen (SV40) waarover de probasin promoter 10. Een mannetjes kunnen worden gebruikt voor deze werkwijze. Terwijl TRAMP tumoren kunnen worden geoogst op elke leeftijd, moet worden opgemerkt dat TRAMP prostaattumoren is over het algemeen klein blijven tot de muizen te bereiken leeftijd van meer dan 20 weken. Euthanaseren muizen door CO 2 stikken. Verwijder het urogenitale kanaal (UGT), door het opensnijden van de buikholte en het terugtrekken van de vetweefsel. Vetweefsel is schuimig, glinsterend op zoek weefsel. Ga naar de blaas, het ligt direct tussen de twee grote, witte zaadblaasjes. Houd op de blaas met een pincet. Houd de schaar gesloten, gladder maken van vetweefsel en zoek de plasbuis. Verminder op de urethra zo dicht mogelijk bij de bekkengordel mogelijk en verbreken de zaadleider. Tijdens het kappen, tegelijkertijd omhoog te trekken op de blaas. Hierdoor komt de gehele UGT nu kan micro-ontleed om elk van de lobben van de prostaat verkrijgen. Plaats de UGT bij kamertemperatuur PBS. Gebruik een dissectie microscoop om de UGT visualiseren en ruimen het overtollige vetweefsel. Met behulp van een tang, vast te houden aan de urinebuis en het verzamelen van de ventrale, laterale en de voorste lobben van de prostaat. Plaats het weefsel in PBS, terwijl je verzamelt de rest van de lobben. Verwijder de zaadblaasjes en gooi deze weg. Draai de resterende weefsel 180 °. Verzamel de ampullary klier en dorsale prostaat lobben. Met behulp van een tang, plagen elkaar de prostaat weefsel en plaats deze in de spijsvertering (dissociatie) buffer. Place tumorweefsel in 1 ml buffer dissociatie (100 U / ml Collagenase IV en 100 pg / ml DNase in RPMI + 10% FBS). Elke tumor kan require unieke dissociatie voorwaarden, want TRAMP prostaattumoren, gebruik dan 1 ml en voor B16 tumoren, gebruik maken van 5 ml (zie hieronder). Opmerking: de mate van Collagenase (I-IV) afhankelijk van de celpopulatie te geïsoleerd, myeloïde cellen isolatie beste type IV, dat lymfocyten opbrengst hoger gebruikt type I. Place buis 37 ° C incubator gedurende 30 minuten. Pipetteer en neer een pipet 1 ml van een gemakkelijk stromend enkele celsuspensie krijgen. Filter suspensie door 70 micron filter en was 3x met Macs scheiding buffer aangevuld met 10% FBS voor myeloïde cel isolatie. Centrifugeer celsuspensie 400 g gedurende 10 minuten. Spoel vervolgens de pellet met 10 ml buffer en MAC's Centrifugeer opnieuw met dezelfde instellingen. Resuspendeer de cel pellet in 100 ui MAC's buffer. Vervolgens voegt 1 mg anti-CD16/32 antilichaam (Ab) per 10 8 cellen (200 pi 2.4.G2 hybridoma supernatant) en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Let op: tHet bedrag van FcR-γ blokkerend antilichaam (Ab) toe te voegen kan afhankelijk van de frequentie / aantal FcR-γ + cellen in het weefsel en het volume van de celsuspensie en daarom kan deze stap nodig optimalisatie. Voeg 100 ul "Pan-DC" of 10 ul van anti-CD11b, anti-CD11c of anti-PDCA-1 microbolletjes per 10 8 totaal cellen, afhankelijk van de gewenste celpopulatie. Opmerking: de vereiste hoeveelheid microkorrels kan afhankelijk van de frequentie / aantal cellen van de gewenste populatie op de weefsels derhalve kan deze stap nodig optimalisatie. Meng goed door zachtjes te vegen buis (Niet Vortex) en incubeer gedurende 15 minuten bij 4-8 ° C, afgeschermd van licht. Niet incuberen op ijs. Was cellen door 10 ml MAC buffer. Centrifugeer 400 g gedurende 10 minuten. Giet supernatant volledig en resuspendeer cellen in 500 pi van MAC's buffer. Tumor celsuspensies stromen beter door de LC-kolommen. (Anderekeuzes: MS, LS, LD). Breng een nieuwe kolom aan de magneet separator. Prime de kolom te spoelen met een geschikte hoeveelheid MK buffer voor geselecteerde kolom: voor LC en MS kolommen 500 ul. Voor LS-of LD-kolommen te gebruiken 1 ml. Na het vullen van de kolom toepassing celsuspensie op de top van de kolom. Gebruik een kolom voor elke 1 x 10 8 cellen. Verzamel ongelabelde cellen (pass-through) en spoel de kolom een ​​minimum van drie (tot vijf) maal met 500 ul volume voor een totaal van 1,5-2,5 ml vloeistof wassen. Voer wasstap een door toevoeging MK buffer aan de kolom is het belangrijk om de kolom stroomt. Zodra de kolom druppel druipt, voeg meer buffer. Laat kolom stand gaan zonder stroom en vermijd dat deze drooglopen (dit mag niet worden onderschat, zoals het drogen van de kolom kan ruïneren zuiverheid en leiden tot een aanzienlijk verlies van levensvatbaarheid van de cellen.). Voor wassen stap 2, spoel de kolom met dissociatie buffer mix (met Collagenase + DNase als debeschreven in stap 1.7), dit dient als een "hardere" wasstap voor het spoelen van plakkerige resten van dode of stervende tumorcellen. Voer wassen stap 3 met MAC-buffer, als de stroom door niet helemaal duidelijk te kijken na het wassen stap 3, blijven wassen voor 2 extra wasstappen met Macs buffer (voor een totaal van 5 wasbeurten). Voor grote subcutane tumoren (bijv. B16 melanoom), tijdens de laatste wasstap, druk zachtjes met een gehandschoende vinger naar de top van de kolom, dit geeft extra vuil voor een schoner, gezuiverd celpopulatie. Deze stap is niet vereist voor vaste delen tumoren zoals prostaat, maar gebruik extra wasstappen wassen in totaal ten minste 5-6 keer. Kolom verwijderen van de magnetische separator en plaats deze op een geschikte collectie buis. Pipetteer 2 ml van de buffer op de kolom. Verzamelen het magnetisch gelabelde cellen door stevig aanbrengen van de plunjer die met de kolom. Tel het aantal cellen en bevestig zuiverheid voor de geselecteerde cel bevolking doorflowcytometrische analyse. Voor de identificatie van de DC-populaties, stelde markers zijn CD45, CD11c, PDCA-1, B220 en CD11b. Aanbevolen macrofaag markers zijn CD45, CD11b, F4-80, en Ly6C. 2. Isolatie van adoptief getransfereerd T-cellen van Subcutane B16 melanoom tumoren Dit protocol werkt het beste met tumoren die 250 mm 2 of minder (geschat door het meten van halverend diameters van de tumor). B16 tumorcellen werden subcutaan geïnjecteerd in C57BL / 6 muizen en tumor metingen zijn opgenomen om de 2 dagen 8. Muizen met tumoren van 250 mm 2 worden gedood door de CO 2 stikken. Met autoclaaf chirurgische instrumenten gespoeld met 70% EtOH, gesneden in kleine tumor (<3 mm) stukjes en incubeer in 5 ml dissociatie oplossing (RPMI medium aangevuld met 5% FBS, Collagenase type I (200 U / ml) en DNase I (100 pg / ml)) gedurende 30 min bij 37 ° C, pipetteren (met een 1000 μl pipet tip) en vortexen elke 10 minuten tijdens de incubatie. Als myeloïde cellen worden vervolgens geïsoleerd, vervangen 5% FBS en Collagenase type I met 10% FBS en Collagenase type IV (200 U / ml), respectievelijk. Na incubatie, passeren celsuspensie door middel van een 70 pm cel zeef en was twee keer met 10 ml MAC's buffer (bereid volgens de instructies van de fabrikant, Miltenyi Biotech). Optioneel – zeer grote tumoren (> 300 mm 2) kan inflammatoire cellen vooraf worden verrijkt met dichtheid gradiënt centrifugatie (Percoll of Ficoll). Zuig het wassen supernatant en voeg 1 pg anti-CD16/32 antibody/10 8 cellen (200 pi kloon 2.4.G2 kweeksupernatant) en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Zonder het wassen, voeg 1 ug anti-Thy1.1 PE antilichaam per 10 8 cellen, meng goed door voorzichtig flicking de buis en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, afgeschermd van licht. Was de cellen om ongebonden pri verwijderenmary antilichaam door het toevoegen van 10 ml MAC's buffer en centrifugeer op 400 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant en voeg 20 ul anti-PE microbolletjes (Miltenyi Biotech) per 10 7 totaal cellen, volgens de instructies van de fabrikant. Meng goed door zachtjes te vegen buis (niet vortex) en incuberen bij 4 ° C (geen ijs) gedurende 15 minuten, afgeschermd van licht. Let op: vortexen kan de integriteit van de kralen te verminderen. Was cellen door het toevoegen van 10 ml van de MAC's buffer en centrifugeer op 400 xg gedurende 5 minuten. Zuig bovenstaande vloeistof, en resuspendeer cellen in 500 ul MAC's buffer. Voor tumoren van een groter formaat (> 300 mm 2) gebruikt 1 ml buffer. Plaats een LC (Large Cell) kolom in het magnetische veld separator. Tumor celsuspensies stromen beste door middel van deze kolommen. Spoel de kolom met 500 ul MACs buffer om de kolom te vullen. De meeste tumoren zullen ook stromen door LS en LD kolommen, maar vereisen verdere vertering en mechanische disruption op het juiste niveau van een enkele celsuspensie te bereiken. Was de kolom met 1 ml MACs buffer om de kolom te vullen. Breng celsuspensie op de kolom en laat deze volledig stromen door (zonder dat de kolom run droog). Vervolgens wassen met 500 ul MAC's buffer, en herhaal het wassen van 3x. Voeg alleen nieuwe buffer wanneer de kolom reservoir leeg is, maar laat de kolom staan ​​zonder stroom. Dit zal leiden tot verstopping en verminderde zuiverheid. Dit is een kritieke grote subcutane tumoren Na de laatste wasstap met een gehandschoende vinger, lichte druk op de bovenzijde van de kolom terwijl de magnetische-afscheider. Dit geeft extra vuil voor een meer puur verrijkt bevolking. Vervolgens was de kolom nog 1 keer met 500 ul MAC's buffer. Kolom verwijderen van de scheider en plaats deze in een schone 15 ml conische buis, voeg 2 ml buffer MAC's op de kolom. Spoel de magnetisch-gelabelde cells door stevig indrukken van de zuiger in de kolom. Centrifugeer de geëlueerde fractie 400 g gedurende 5 minuten. Zuiverheid in deze stap is gewoonlijk tussen 75-80%. Om> 90% zuiverheid te bereiken, herhaalt de magnetische scheiding zoals beschreven in stap 1.10-1.12 met een nieuwe MS kolom. De MS kolom kleiner en compact zodat de suspensie zal trager door de kolom, maar levert een groter aantal en de zuiverheid van de cel van belang. Tel het aantal cellen voor verdere experimenten en controleer zuiverheid flowcytometrische analyse. Voor de isolatie van adoptief overgedragen T-cellen, zoals die beschreven in dit protocol, allelische markers voor identificatie zijn CD45 en Thy1.1 (overgedragen cellen) en Thy1.2 (host T-cellen). 3. Representatieve resultaten De opbrengst van een bepaalde celpopulatie (bijvoorbeeld macrofagen DC T-cel, enz.) afhankelijk van de grootte van de tumor en behandelingen waren administered tijdens de groei van de tumor. Een prostaat van een onbehandelde 14-16 weken oud TRAMP muis moet opleveren tussen de 8×10 5-1×10 6 CD11c + / PDCA-1 + (DC)-cellen bij 90-95% zuiverheid of 1×10 6-1.5×10 6 F4/80 + / CD11b + (macrofagen) op 80-90% zuiverheid van 300 mg weefsel na isolatie protocol hierboven weergegeven in figuur 1. Het aantal van elk van deze cellen enigszins vergroot bij adoptieve overdracht van tumor-antigeen-specifieke T cellen. Slechte zuiverheid gewoonlijk het gevolg van onvoldoende wassen, zodat de kolom te drogen (wat kan resulteren in tumor vuil behouden in de kolom), of onvoldoende Fc-receptor te blokkeren. Evenzo wordt de totale geïsoleerd uit B16 tumoren ook afhankelijk tumorgrootte bij de weefsel oogst adoptieve overdracht van T-cellen (overdracht van 5×10 6) met of zonder DC vaccin (overdracht van 1×10 5). Zeer weinig antigeen-specifieke T-cellen van de tumor te infiltreren, tenzij een antigeen-gepulste DC-vaccin wordt ook een dag na de T-cel-overdracht. Als een DC vaccin wordt een muis met een klein voelbare (<50 mm 2) tumor, wordt een opbrengst van ongeveer 3×10 5 Thy1.1 + T-cellen met een zuiverheid van 80-85%, wordt beschouwd als een "goede "oogsten zoals weergegeven in figuur 2A. Indien grotere tumoren geoogst, zal de totale opbrengst en zuiverheid worden verminderd. Macrofagen (F4/80 + / CD11b +) zijn meestal een lager percentage van de totale cellen B16 tumoren. Figuur 2B toont dat het gebruik CD11b van een tumor die 250 mm 2 geeft ongeveer 1×10 6 macrofagen bij 90-95% zuiverheid . Bovendien Figuur 2B toont de DC populatie B16 tumoren heterogeen zijn. In tegenstelling tot de prostaat tumoren, twee subpopulaties: CD11c + / PDCA-1 + (plasmacytoïde DC) en CD11c+ / PDCA-1 – (conventioneel DC) kunnen worden verkregen B16 melanoma tumoren. Naar schatting 2×10 6 PDC en 4×10 6 CDC wordt verwacht van 250 mm 2 B16 tumoren op 80-90% zuiverheid. Minder zuiverheid is meestal een gevolg van het niet opruimen van de tumoren cellen van de kolom. Stap 2,12 is een belangrijke stap de kleine klomp melanoom cellen die blijft aan de basis van de kolom verwijderd. Na deze stap verbetert de doelmatigheid van de wasstappen en resulteert in een betere zuiverheid. Figuur 1. DCs (CD11c + / PDCA-1 +) en macrofagen (F4/80 + / CD11b +) werden geïsoleerd uit een TRAMP prostaatkanker. Dot perceel waarden vertegenwoordigen percentage van de cellen van belang pre-of post-zuivering. Figuur 2 (A). Adoptively overgedragen Thy1.1 + / CD8 + T cellen en (B) myeloïde cellen inclusief CD11c + / PDCA-1 + plasmacytoïde DCs, CD11c + / PDCA-1 – conventionele DCs en F4/80 + / + CD11b macrofagen werden geïsoleerd uit subcutaan B16 melanoom tumor uit Thy1.2 + muizen. Dot perceel waarden vertegenwoordigen percentage van de cellen van belang pre-of post-zuivering.