Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Electroforese em gel de agarose provou ser um modo eficiente e eficaz de separar ácidos nucleicos. Força de agarose de gel de alta permite a manipulação de géis percentuais de baixo custo para a separação de fragmentos de ADN de grande porte. Peneiração molecular é determinado pelo tamanho dos poros gerados pelos feixes de agarose ⁷ na matriz de gel. Em geral, quanto maior a concentração de agarose, quanto menor o tamanho dos poros. Géis de agarose tradicionais são mais eficazes na separação de fragmentos de ADN entre 100 bp e 25 kb. Para separar fragmentos de ADN maiores do que 25 kb, uma será necessário usar pulso electroforese em gel de campo ^6, que envolve a aplicação de corrente alternada a partir de duas direcções diferentes. Deste modo maiores fragmentos de DNA são separados por tamanho a velocidade a que eles reorientar-se com as mudanças na direcção da corrente. Os fragmentos de DNA mais pequenos do que 100 pb são mais eficazmente separados usando electroforese em gel de poliacrilamida. Ao contráriogéis de agarose, a matriz de gel de poliacrilamida é formada através de uma reacção química de radical livre accionado. Estes géis são mais finas de maior concentração, são executados na vertical e tem uma melhor resolução. No DNA moderna sequenciação electroforese capilar é usado, em que tubos capilares são preenchidos com uma matriz de gel. A utilização de tubos capilares permite a aplicação de tensões elevadas, permitindo assim a separação de fragmentos de DNA (e à determinação da sequência de ADN) rapidamente.

Agarose pode ser modificada para criar baixo ponto de fusão de agarose através hydroxyethylation. Baixo ponto de fusão de agarose é geralmente usado quando o isolamento de fragmentos de DNA separados é desejada. Hydroxyethylation reduz a densidade de empacotamento dos feixes de agarose, reduzindo efectivamente o seu tamanho de poro ^8. Isto significa que um fragmento de ADN do mesmo tamanho levará mais tempo para se mover através de um baixo ponto de fusão gel de agarose em oposição a um gel de agarose padrão. Porque os feixes associar com um outroatravés de interacções não covalentes ^9, é possível re-derreter gel de agarose um depois de ter definido.

EtBr é o reagente mais comum utilizado para corar o DNA em géis de agarose a ^10. Quando exposta à luz UV, os electrões no anel aromático da molécula de etídio são activadas, o que leva à libertação de energia (luz) como o retorno electrões para estado fundamental. EtBr funciona por intercalando-se na molécula de ADN de uma forma dependente da concentração. Isto permite a uma estimativa da quantidade de DNA em qualquer banda de DNA particular com base na sua intensidade. Devido à sua carga positiva, o uso de EtBr reduz a taxa de migração de DNA em 15%. EtBr é um agente mutagênico e carcinogênico suspeito, portanto é preciso cuidado ao manusear géis de agarose que o contenham. Além disso, é considerado um EtBr resíduos perigosos e devem ser eliminados de forma adequada. Manchas alternativos para DNA em gel de agarose incluem SYBR Gold, SYBR verde, Cristal Violeta Metil e Azul. Destes,Metil Blue e Cristal Violeta não requerem a exposição do gel à luz UV para a visualização das bandas de DNA, reduzindo assim a probabilidade de mutação se a recuperação do fragmento de ADN a partir do gel é desejada. No entanto, as suas sensibilidades são mais baixos do que a de EtBr. SYBR ouro e SYBR verdes são ambos altamente sensíveis, uv corantes dependentes, com menor toxicidade do que EtBr, mas são consideravelmente mais caros. Além disso, todos os corantes alternativos ou não pode ser ou não funcionam bem quando adicionado directamente ao gel, portanto, o gel terá de ser coradas pós após a electroforese. Devido à facilidade de custo, de uso, e sensibilidade, EtBr continua a ser o corante de escolha para muitos investigadores. No entanto, em determinadas situações, tais como quando a eliminação de resíduos perigosos é difícil ou quando jovens são realizar um experimento, um corante menos tóxica pode ser preferido.

Corantes de carregamento utilizadas no eletroforese em gel de servir a três propósitos principais. Primeiro adicionam densidade para a amostra, Permitindo que a afundar-se no gel. Em segundo lugar, os corantes proporcionar cor e simplificar o processo de carregamento. Finalmente, os corantes mover na taxa padrão através do gel, o que permite para a estimativa da distância que os fragmentos de DNA ter migrado.

As dimensões exactas dos fragmentos de DNA separados pode ser determinada através da representação gráfica do logaritmo do peso molecular das bandas diferentes de um padrão de DNA contra a distância percorrida por cada banda. O padrão de DNA contém uma mistura de fragmentos de ADN de tamanhos pré-determinados que podem ser comparados contra as amostras de DNA desconhecidos. É importante notar que as diferentes formas de ADN mover-se através do gel com taxas diferentes. DNA de plasmídeo superenrolado, devido à sua conformação compacta, se move através da rápida em gel, seguida por um fragmento de DNA linear do mesmo tamanho, com a forma circular aberta viajando o mais lento.

Em conclusão, uma vez que a adopção de géis de agarose na década de 1970 para a separação de DNA, que temprovado ser uma das técnicas mais úteis e versáteis na investigação ciências biológicas.