Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Elettroforesi su gel di agarosio ha dimostrato di essere un modo efficiente ed efficace di separare acidi nucleici. Elevata forza di gel di agarosio permette per la movimentazione di gel basse percentuali per la separazione di frammenti di DNA di grandi dimensioni. Setacciatura molecolare viene determinata dalla dimensione di pori generati dai fasci di agarosio ⁷ nella matrice gel. In generale, maggiore è la concentrazione di agarosio, minore è la dimensione dei pori. Tradizionali gel di agarosio sono più efficaci alla separazione dei frammenti di DNA da 100 bp e 25 kb. Per separare frammenti di DNA più grandi di 25 kb, si dovranno usare elettroforesi su gel di impulsi di campo ^6, che consiste nell'applicazione di corrente alternata da due diverse direzioni. In questo modo i frammenti più grandi di DNA di dimensioni sono separati dalla velocità con cui si riorientare con i cambiamenti di direzione della corrente. Piccoli frammenti di DNA di 100 bp sono più efficacemente separati usando elettroforesi su gel di poliacrilammide. A differenza digel di agarosio, la matrice di gel di poliacrilammide è formato attraverso una reazione radicali liberi chimica condotta. Questi gel sono più sottili di una maggiore concentrazione, sono gestite in verticale ed avere una migliore risoluzione. Nella moderna sequenziamento del DNA elettroforesi capillare viene utilizzato, quale tubi capillari sono riempiti con una matrice di gel. L'impiego di tubi capillari consente l'applicazione di tensioni elevate, consentendo la separazione di frammenti di DNA (e la determinazione della sequenza di DNA) rapidamente.

Agarose può essere modificato per creare fusione basso agarosio attraverso hydroxyethylation. Agarosio a bassa fusione viene generalmente utilizzata quando l'isolamento di frammenti di DNA separati si desidera. Hydroxyethylation riduce la densità di impaccamento dei fasci di agarosio, riducendo le dimensioni dei pori ^8. Ciò significa che un frammento di DNA della stessa dimensione avrà più di muoversi attraverso un gel di agarosio a bassa fusione rispetto a un normale gel di agarosio. Poiché i fasci associarsiattraverso interazioni non covalenti ^9, è possibile rifondere un gel di agarosio dopo che è impostato.

EtBr è il reagente più comune utilizzato per colorare DNA in gel di agarosio ^10. Se esposto a luce UV, elettroni l'anello aromatico della molecola etidio vengono attivati, che porta alla liberazione di energia (luce) come ritorno elettroni allo stato terra. EtBr funziona intercalando stessa nella molecola di DNA in maniera dipendente dalla concentrazione. Ciò consente una stima della quantità di DNA in una banda di DNA particolare sulla base della sua intensità. A causa della sua carica positiva, l'uso del EtBr riduce il tasso di migrazione DNA del 15%. EtBr è un sospetto mutageno e cancerogeno, quindi si deve fare attenzione quando si maneggiano gel di agarosio che lo contengono. Inoltre, EtBr è considerato un rifiuto pericoloso e deve essere smaltito in modo appropriato. Macchie alternative per DNA in gel di agarosio sono SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet e blu metile. Di questi,Metile blu e Crystal Violet non richiedono l'esposizione del gel di luce UV per la visualizzazione delle bande di DNA, riducendo così la probabilità di mutazione se il recupero del frammento di DNA dal gel è desiderata. Tuttavia, la loro sensibilità è inferiore a quello di EtBr. SYBR oro e SYBR green sono entrambi molto sensibili, coloranti uv dipendenti con minore tossicità rispetto EtBr, ma sono notevolmente più costosi. Inoltre, tutti i coloranti alternativi o non può essere o non funzionano bene quando aggiunto direttamente al gel, il gel pertanto dovrà essere tinto posto dopo elettroforesi. A causa dei costi, facilità d'uso e sensibilità, EtBr rimane ancora la tintura di scelta per molti ricercatori. Tuttavia, in determinate situazioni, come ad esempio quando lo smaltimento dei rifiuti pericolosi è difficile o quando i giovani studenti eseguono un esperimento, un colorante meno tossico può essere preferito.

Caricamento dei coloranti utilizzati in elettroforesi su gel risponde a tre obiettivi principali. In primo luogo si aggiunge la densità al campione, Permettendo così di sprofondare nel gel. In secondo luogo, i coloranti fornire colore e semplificare il processo di caricamento. Infine, i coloranti muovono a velocità standard attraverso il gel, consentendo la stima della distanza che frammenti di DNA sono migrati.

Le dimensioni esatte di frammenti di DNA separati può essere determinata tracciando il logaritmo del peso molecolare per diverse bande di DNA standard contro la distanza percorsa da ciascuna banda. Lo standard DNA contiene una miscela di frammenti di DNA di predeterminate dimensioni che possono essere confrontati con i campioni di DNA sconosciuti. È importante notare che diverse forme di DNA muovono attraverso il gel a velocità diverse. DNA plasmidico superavvolto, a causa della sua conformazione compatta, si muove attraverso il gel più veloce, seguito da un frammento di DNA lineare della stessa dimensione, con la forma circolare aperta viaggiare più lenta.

In conclusione, dopo l'adozione di gel di agarosio in 1970 per la separazione del DNA, hadimostrato di essere una delle tecniche più utili e versatili ricerca scienze biologiche.