Bakåtsträvande Fluorescerande märkning Tillåter Riktade Extracellular Single-enhet Inspelning från identifierade nervceller<em> In vivo</em

Ett. Förbered Dye-belagda Needles Elektrolytiskt vässa en 160 ìm diameter 15 volfram tråd. Slutliga nål spetsdiametrar bör variera från 5 till 50 | im. Antalet behövs nålar beroende på regionens storlek märks. Vi förberedde 5 nålar för 3-5 injektioner i bakre exterolateral kärnan (ELP). Kvällen innan experimentet, placera en droppe (<0,25 l) av 2 mM dextran-konjugerad Alexa Fluor 10.000 MW färgämne på den distala 100 nm för varje nål. Låt nålar för att lufttorka vid rumstemperatur och lämnar koncentrerade färgämnet vid spetsen. Förvara nålar vid 4 ° C i en mörk behållare för att skydda dem från ljus. 2. Förbered djur för kirurgi Framkalla narkos genom att placera fisken i en lösning av 300 mg / L MS-222 i tank vatten. Väg fisken och mät gaffellängd (spets nos till gaffel av stjärtfenan) och kropp djup (maximal dorso-Ventral avståndet i det tvärgående planet). Dessa mätningar bör falla inom de intervall som anges i tabell 1 så att fisken passar inuti en inspelning kammare tillräckligt liten för att placera under vattens nedsänkning mikroskopobjektiv (Figur 1). Immobilisera och elektriskt tysta fisken genom att injicera 100 | il av 3 mg / ml flaxedil i den dorsala kroppen muskulatur. Fyll inspelningen kammare (Figur 1A) med tank vatten. Placera fisken ventrala nedåt på plattformen i mitten av kammaren (figur 1). Leverera en luftad lösning av 100 mg / L MS-222 med användning av en pipettspets placeras i fiskens mun (1-2 ml / min). Stabilisera fisken med stavar som fastställs i vax placeras på båda sidor av kroppen (Figur 1C). Övervaka fiskens hälsa genom att kontrollera för kontinuerligt blodflöde i de okulära kärl och en normal kropp färg. Rotera plattformen längs dess långa axel och sänk den bakre änden av PLATFORM så att ena sidan av den dorsala ytan av huvudet på fisken är exponerat ovanför vattnet medan resten av fiskens kropp förblir nedsänkt. En liten bit av Kimwipe bör placeras på en icke-nedsänkta delen av huden för att förhindra uttorkning. Tre. Kirurgi (figur 2) Den grundläggande kirurgisk procedur som beskrivs här är väl etablerat och tillförlitligt används för blinda in vivo inspelningar i mormyrids 16. För andra applikationer, exponera de önskade områdena för märkning och registrering. Regionen innehåller axonterminaler av cellerna av intresse skall kunna nås genom ett färgämne-belagda nålar. Regionen innehållande mer proximala segment av samma axoner ha tillräckligt med utrymme ovanför vävnaden att rymma arbetsavståndet av typen vatten-nedsänkning lins (2 mm i vårt fall). Applicera en 0,4% lösning av lidokain på den exponerade ytan av huvudet med hjälp av en tops. Använda ett skalpellblad, skär omkretsen av en rektangulär bit hud. Ta rektangeln med hjälp av en pincett. Storleken på rektangeln skalas med fiskens storlek, men bör vara ca 3 mm x 5 mm för en 6,2 cm fisk (Figur 2A). Den laterala kanten av rektangeln bör anpassa sig till mitten av ögat, bör den främre kanten av rektangeln vara precis posteriort om ögat, och den mediala kanten av rektangeln ska vara precis lateralt om fiskens mittlinjen. Expandera den exponerade skallen regionen anteromedially att exponera ytterligare 2,5 mm kvadratisk icke-överlappande området (Figur 2B). Helt klart och torka den exponerade ytan av skallen med skalpell blad för att skrapa bort överflödigt vävnad och Kimwipes och varmluft för att torka ytan (figur 2C). Limma en metall post till anteromedial exponerade skallen region med superlim. Vänta tills limmet är helt torrt (Figur 2D). </li> Ta bort en rektangel av skallen, ca 2 mm x 4 mm för en 6,2 cm fisk. Använd en tandläkarborr med en ~ 0,5 mm i diameter kulkvarn hårdmetallskär att tunna omkretsen av rektangeln. Med användning av en skalpell och pincett, skär omkretsen av rektangeln och skala bort det för att exponera den underliggande hjärnan. Ytterligare borrning eller skärning med en liten sax kan vara nödvändigt för att till fullo exponera EL (Figur 2E). Om muskel blödning uppstår, kan en diatermi enhet användas. Skär bort både dura mater (pigmenterad) och Pia mater (klar) med Spring sax eller en nål och ta bort de avskurna delarna med en pincett. De främre och bakre delarna av exterolateral kärnan (EL) är nu synliga, ELA och ELP, respektive (figur 3A). 4. Retrograd Märkning av axoner av intresse Placera en manipulator med en dye-belagd nål (gjord i steg 1) över målet regionen innehåller axoner av intressantat, i vårt fall ELP. Snabbt in nålen ca 25 um i vävnaden. Vänta 15-30 sekunder, tills all färg har lossnat, och sedan dra in nålen. Upprepa med ytterligare friska barr som behövs, placera var och en i en annan plats så att färgen fördelas över hela målområdet. Vi använde 3-5 nålar per beredning. Skölj överskottsfärg från hålrummet med Hickman Ringer lösning. Vänta minst 2 timmar för färgämnesupptagning och transport. Fem. Visualisering av axoner av intresse Placera inspelningen kammaren, tillsammans med fisken, under målet om en upprätt, fast-stadiet epifluorescensmikroskop. Eftersom kroppen av fisken täpper ljuspenetrering, måste både vita och fluorescerande ljuskällor kommer från ovan. Noggrann placering av en fiberoptisk ljuskälla ovanför skallen hålighet tillåter tillfredsställande brightfield bilder. För epifluorescens visning, fluorescens filterspecifikationer ska matcha absorptions / emissionsspektrum av färgämnet. Växla andning till frisk tank vatten och bibehålla samma flödeshastighet. Placera en jordkabel i exponerade hjärnan hålrum och ansluter till marken av inspelningen headstage (se 6.3). Placera ett par registreringselektroderna bredvid svansroten och ansluta till en differential förstärkare och inspelningsenhet (t.ex. audio monitor, oscilloskop, eller dator) för att övervaka den elektriska kommandot orgel urladdning (EODC). Efter fisken återhämtar sig från anestesi, kan EODC användas som en indikator på fiskens tillstånd. Förbered en skalad skiss av hjärnregion ses vid låg förstoring. Inkludera större blodkärl som landmärken (kan variera från fisk till fisk) för att identifiera den exakta platsen för märkta axoner synliga endast under hög förstoring (Figur 3D). Bekräfta färgämne placering. Först visa hela vävnad med ljusfält belysning för orientering ( <strong> Figur 3A). Sedan visa med fluorescerande belysning (Figur 3B). ELP kommer att ha diffus märkning (figurerna 3B och 3C). Minimera fluorescensexcitation att begränsa fotodynamiska och fototoxiska effekterna av färgämnet. Använd de fartyg som landmärken för att hitta ELA under hög förstoring. Belys med fluorescerande ljus när han letade efter en märkt axon nära ytan. (Figur 4). 6. Spela in Extracellulär aktivitet Dra elektroder sug inspelning med 1 mm OD, 0,58 mm ID borosilikatglas kapillär glas med glödtråd. Ideal spetsstorlek beror på diametern av målet axoner, som i vårt fall är 0,1-0,2 um 17. För vår ansökan, var elektrod spetsdiametrar 1,5 ± 0,4 pm (intervall: 1,0-2,4 mikrometer) med en 5 mm lång, smal skaft för att närma märkta axoner utan att flytta den omgivande tätt packade vävnad. Fyll eltroder med filtrerad Hickmans Ringer-lösning. Sista tips motståndet är 45,2 ± 38,0 Mohm (intervall: 16-155 MQ). Placera elektroden i en elektrodhållare med ett tryck port och anslut den till en förstärkare headstage monterad på en manipulator. Kör en tryckledning från trycket hamnen till en T-korsning slutar i en manometer och en spruta för att övervaka och kontrollera tryck, respektive. Anslut headstage till en förstärkare och en analog-till-digital ackvisitionsanordningen. Med 30 mbar tryck utåt i elektroden linje, placera en elektrod intill en märkt axon. En låg ljusnivå kamera gränssnitt med imaging programvara används för att visualisera pipett placering. Börja nära vävnaden ytan och föra elektroden mot axonet. När du närmar dig axonet, bör den yttre trycket orsaka en liten, men märkbar rörelse axonet. Medan elektroden är bredvid axonet, (figur 4A, överst) registrera den potentaIAL vid elektroden samtidigt presentera testa stimuli (i vårt fall använde vi 100 ms monofasiska positiva och negativa tvärgående pulser vid en intensitet på 20 mV / cm; Figur 1A). Aktionspotentialer bör inte iakttas, även om en elektrisk artefakt bekräftar ordentlig inspelning / stimulering (Figur 4A, botten). Släpp utåtriktat tryck på elektroden och upprepa stimulans / inspelning. Aktionspotentialer bör ändå inte observeras (Figur 4B). Applicera lätt (125 ± 25 mbar) sug till elektroden och upprepa stimulans / inspelning. Aktionspotentialer bör nu observeras som svar på stimulering (Figur 4C). Spontan aktivitet kan också förekomma. Om aktionspotentialer inte följs, släpper sug, rensa elektroden med lätt tryck, flytta elektroden något, och försök sug igen. När aktionspotentialer är synliga, stäng tryckledningen. Stimulera och spela in somönskas. 7. Uppsägning och kassering När alla önskade inspelningar är klar, växla till andning med 100 mg / L MS-222 tills EODC har stoppats. Ingen EODC bör påvisas under minst 10 minuter. Avyttra fisken i enlighet med institutionella riktlinjer och godkända djur protokoll vård. 8. Representativa resultat För vår särskild applikation, är vi intresserade av att studera stimulans kodning av centrala sensoriska neuroner. Lyckade inspelningar från märkta axoner tillåter analys av en enda enhet svar på sensorisk stimulering 18. Figur 5A visar representativa aktionspotentialer framkallas av tvärgående electrosensory stimulering med bipolära elektroder placerade på insidan av den vänstra och högra väggar inspelningen kammaren. Spike gånger kan presenteras som en spik raster plot (figur 5B). En 25 msek före stimulus inspelning vindow visar den låga nivån av spontan aktivitet. Denna speciella ELA "småcellig" är lång-pass avstämd till stimulus varaktighet vid en stimulusintensitet av 6 mV / cm, öka antalet spikar per upprepning som ökar stimulusduration (Figur 5C). Medelvärdet första spiken latens är 4,28 ± 0,16 ms, överensstämmer med den förväntade latens för små celler i ela 11. Figur 1. Specifikationer för en inspelning kammare som kan passa under målet om ett fast steg epiflourescent mikroskop. (A) Till skala fyrkantig inspelning kammare gjorda av plexiglas visar toppen, sidan och tillbaka utsikt. Parade uppsättningar av stimulerande elektroder (asterisker) i periferin möjliggöra antingen tvärgående (röd-svart) eller longitudinell (blå-gul) stimulering. En extra bit plexiglas i hörnet, med en gummi-fodrad hål i mitten (orange),innehar ett sug pipett som upprätthåller en konstant vattennivå. Två vertikala rostfria inlägg skruvade i botten av kammaren (fast grön) ansluta till rostfria inlägg (grön kontur) fästa vid plattformar som hanterar fisken (ljusgrå, som beskrivs i C) via justerbara skiva klämmor. Ett fotografi av kammaren visas under till-skalenlig ritning. (B) Enskilda och sammansatta vyer av de cirkulära plastskiva klämmor används för att säkra plattformen till de vertikala stolparna. Varje skiva klämma har ett spår (grön) för en post och ett centrumhål för spännskruven. Disc klämmor är svängda så att spåren är vinkelräta mot varandra. Åtdragning av skruven (röd) klämmor stolparna på plats för att förhindra ytterligare vertikal och roterande rörelse av plattformen. (C) Främre och från sida till skala vyer av plexiglas plattform som används för att hålla fisken på plats. Plattformen är belagd med ett skikt av paraffin vax (blå) som rymmer trä Dowels (svarta staplar) på plats för att stödja fisk. Slangar för respirating fisken passerar genom ett hål i "headboard" av plattformen och slutar i en pipettspets placeras i fiskens mun. En rostfri huvud inlägget (grå stapel) ansluter till plattformen via en kulled möjliggör 360 graders rotation. Rostfria horisontella inlägg (grön) är inskruvade i vardera änden av plattformen. Klicka här för att visa en större bild . Figur 2. Schematisk översikt av kirurgi tittar ner på den dorsala ytan av huvudet. (A) Gör fyra snitt, i angiven ordning, att ta bort en rektangulär bit hud (rött). (B) Förläng öppningen anteromedially att ta bort ytterligare en rektangulär bit av huden (grön). (C) Skrapa bort eventuella kvarvarande fett eller ligament frånflytta skalpell blad som indikeras av pilen och torka ytan helt med Kimwipes och forcerad luft. på skallen med superlim (D) Limma en rostfri post. Skala bar i A gäller AD. (E) Använd en Tandläkarborrmaskiner att göra fyra snitt, i angiven ordning, att ta bort en rektangulär bit ben (blått), utsätta den främre och bakre exterolateral kärnor (ELA och ELP, respektive) . Klicka här för att visa en större bild . Figur 3. Fluorescerande märkning i den bakre exterolateral kärnan 3 timmar efter injektion av dextran-konjugerad Alexa Fluor 568. (A) främre och bakre exterolateral kärnor (ELA och ELP, respektive) visualiserades med ljusa fältbelysningen ovanifrån. Anmärkningatt den omfattande myelination inom ELA ger det en relativt ljusa utseende som skiljer den från ELP. (B) Samma område visualiseras med epifluorescence betraktas genom ett TRITC filter. (C) En sammanfogad bild med blått för A (ljusfält) och rött för B (TRITC). (D) Exempel på en skalad ritning av ela och ELP inklusive större blodkärl (röda linjer) som kan användas som landmärken för att identifiera den exakta platsen för märkta axoner synliga endast under hög förstoring (den exakta platsen av blodkärl varierar från fisk till fisk). Streckade linjen visar gränsen mellan ela och ELP. (E) Exempel på bilder förvärvas med hjälp av en TRITC filter från fem olika preparat som illustrerar ett sortiment av framgångsrika märkning mönster av småcelliga axoner och SOMAS i ela. Figur 4. Single-enhet extracellulära inspelningfrån en märkt axonet. (A) Inspelning elektrod (pilspets) under positivt tryck placeras intill en märkt småcellig axonet i ELA (överst) registrerar endast kant artefakt (pilhuvuden) som svar på en 100 ms 20 mV / cm monofasiska, kontralaterala-positiv, tvärgående fyrkantspuls (botten). (B) Släpper utåtriktat tryck från elektroden (pilspets) orsakar axonet flyttas en aning mot elektroden (överst), men det finns fortfarande inga svar på stimulus (botten). ( C) svagt undertryck drar axonet i elektroden (överst, pilspets) och potentialer åtgärder som svar på stimulans debut är nu synliga (botten, asterisk). Nedre delarna av alla tre paneler är överlagrade svar på 20 upprepningar av stimulus. Figur 5. Representativa resultat som använder denna teknik. (A) 5 prov spårvisar aktionspotentialer framkallade av en 0,1 ms 6 mV / cm monofasiska, kontralateral-positiv, tvärgående fyrkantspuls stimulans. (B) Raster plot visar spik gånger under 20 upprepningar av en 75 ms inspelning fönster för samma enhet stimuleras vid tidpunkten 0 med 6 mV / cm stimuli på olika löptider som anges till höger. (C) Speltid stämningskurva kvantifiera svaren visas i rastret som spikar per stimulans upprepning. Massa (g) Gaffel Längd (cm) Body Djup (cm) Medelvärde 2,42 6,20 1,14 Standardavvikelse 0,64 0,52 0,18 Range 1,2-4,0 5,5-8,4 0,9-1,6 Tabell 1. Optimalvikt, längd och kropp spänner djup för fisk. Optimal vikt, gaffellängd (tips på nos till gaffel av stjärtfenan) och kropp djup (maximal dorso-ventral avstånd i tvärgående planet) varierar tillåter fisken att passa in inspelningen kammaren illustreras i Figur 1. Fisk som är för liten kan vara mindre benägna att överleva operationen och kommer att ha en liten ELP, vilket färgämne placering utmanande. Fisk som är för stora kommer att ha en stor, över långtgående lillhjärnan som kommer att minska tillgången till ELA och ELP och kan förhindra sänkning av hög effekt, vatten-immersionsobjektivet tillräckligt nära för att fokusera på ela och ELP. Ansökan Site Dye Typ Fisk försökte Etikett i ela Tillverkare i ELP Enheter försökte Inspelningar ELen Alexa Fluor injektion 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 4 (8,0%) Ela Alexa Fluor indränkt filterpapper 1 0 0 0 0 Ela Di-I i DMSO 8 6 (75.0%) 0 0 0 Ela Di-O kristaller 5 3 (60.0%) 2 (40.0%) 9 0 ELP Solid Alexa Fluor kristaller 2 0 2 (100%) 0 0 ELP Alexa Fluor belagda volfram trådar 43 <strong> 29 (67,4%) 41 (95,3%) 119 26 (21,8%) Tabell 2. Framgång priser för varje färgämne injektion metod. Framgång priser för varje färgämne injektion metod. Metoder är indelade baserat på injektionsstället och färgtyp. För varje metod försökte det totala antalet fiskar och den procentandel av dessa experiment som resulterade i framgångsrik märkning i ela och ELP visas. Observera att det riktade inspelningen området är motsatsen till applikationsstället (fetstilta lådor). För injektionsstället, var färgämnesupptagning vara framgångsrika med märkning av både SOMAS och axoner. Däremot på inspelningsplatsen, var bara beredningar märkta axoner räknas som framgångsrika märkning experiment. Det totala antalet försök enheter och andelen av dessa enheter som resulterade i framgångsrika inspelningar visas också. # Antal injektion sites Genomsnittlig volym per injektion (pl) Utbud av volymer per injektion (pl) Genomsnittlig total injektion volym (il) Utbud av kompletta injektionsvolymer (pl) Microinjector med Hamilton 3 eller 4 0,144 0,091-0,91 0,516 0,378-0,669 Nanoinjector med glaspipett 2 – 4 för 0,069 (fast) Fast volym injiceras 1-6 gånger 0,621 0,414-0,966 Microinjector med glas pipett 2 – 6 0,093 0,058-0,202 0,360 0,252 till 0,540 Tabell 3. Mängder av färgämne tillämpas för varje av de tre metoder som används för att injicera AlEXA Fluor in ela Mängder av färgämne som tillämpas för var och en av de tre metoder som används för att injicera Alexa Fluor in ela (första metoden från tabell 2). Dye injektion i ela utfördes med både en nanoinjector och en mikroinjektor användning av antingen en 33 gauge Hamilton-spruta nål eller en drog glaskapillär pipett. Vi varierade antalet injektionsställen, volymen per injektion och den totala volymen av färgämne injektion.