逆行荧光染料标记允许有针对性的外单细胞记录技术鉴定神经元<em>在体内</em

1。准备染料涂层针电解削直径160微米的钨丝15。最终针尖直径范围从5-50微米。所需的针的数目依赖于被标记的区域的大小。 3-5注入后exterolateral核（ELP），我们准备了5针。 实验的前一天晚上，将2毫米葡聚糖共轭的Alexa Fluor 10,000兆瓦染料到每一针远端100微米的下降（<0.25微升）。 允许针头，在室温下风干，留下浓缩的尖端处的染料。针存放于4℃在黑暗的容器，以保护他们免受光。 2。准备手术的动物诱导全身麻醉300 mg / L的MS-222罐水将鱼放置在一个解决方案。 称取鱼和措施叉长度（吻尖，尾鳍叉）和身体深度（最大背ventra升在横向平面的距离）。这些测量应属于表1中所示，使鱼足够小，以放置下浸水显微镜物镜（ 图1）内的录音室，适合的范围之内。 固定及电沉默的鱼背的身体肌肉注入100微升3毫克/毫升flaxedil。 用水箱水填充录音室（ 图1A）。腹侧边鱼放置在平台上的腔室（ 图1）的中心。提供充气溶液100 mg / L的MS-222，在鱼的嘴下（1-2毫升/分钟）用移液管尖。稳定鱼棒固定在蜡放在身体两侧（ 图1C）。监视鱼的健康检查连续在眼血管的血流量和体色正常。 沿其长轴旋转的平台，并降低平台下的后端鱼的头部一侧的背侧表面露出在水面之上，而鱼的身体的其余部分保持淹没，这样ORM。 Kimwipe一小片应放在任何非淹没的部分，以防止皮肤干燥。 3。手术（ 图2） 这里描述的基本的外科手术已经非常成熟，可靠地用于盲目在体内的录音在mormyrids 16。对于其他应用，暴露所需的区域标记和记录。该地区含有细胞的轴突末梢必须是可达的染料涂层针。该区域含有更近侧段的那些相同的轴突以上的组织必须有足够的空间以容纳水浸没透镜在我们的情况下）（2毫米的工作距离。 应用0.4％利多卡因溶液用棉条头的暴露的表面。 使用手术刀刀片，切开皮肤一块长方形的周长。使用一对镊子取出的矩形。的矩形的大小与鱼的大小进行调整，但应该是约3毫米×5毫米为6.2厘米的鱼（ 图2A）。的矩形的侧边应与眼睛的中心对齐，前边缘的宽度应该是后方的眼睛，和矩形的内侧缘应该只是鱼的横向中线。 展开的暴露颅骨区域前内侧露出一个额外的2.5平方毫米的非重叠的区域（ 图2B）。 彻底清除和干燥颅骨使用手术刀刀片刮走任何多余的组织的Kimwipes和强制空气干燥的表面（ 图2C）的暴露表面。 胶水的金属柱前内侧裸露的头骨区域使用超级胶水。等待，直到胶水完全干燥（ 图2D）。 </LI> 颅骨取出一个长方形，约2毫米×4毫米的为6.2厘米的鱼。使用〜0.5毫米直径的球磨机硬质合金钻头的牙钻薄矩形的周长。然后，用手术刀和镊子，切矩形的周长相差剥离以暴露底层的大脑。其他钻孔或切割用小剪刀可能是必要的，充分暴露EL（ 图2E）。如果发生肌肉出血，电灼单位也可使用。 切开硬脑膜（色素）和软脑膜（清除）使用弹簧剪刀或针和一对镊子取出切成部分。的exterolateral核致发光（EL）的前部和后部的部分现在可以看到，ELA和ELP，（ 图3A）。 4。利息轴突逆行标记用染料涂层的针（在步骤1）中的机械手的位置，上述包含轴突INTERES的所述对象区域T，情况ELP我们。 迅速地将针插入约25微米到组织中。等待15-30秒，直到所有的染料脱落，然后缩回针头。 重复需要额外的新鲜的针，每一个放置在不同的位置，使染料分布在整个目标区域。我们每准备用3-5针。 希克曼林格液腔冲洗多余的染料。 染料的吸收和运输，等待至少2个小时。 5。轴突的可视化将录音室，以及鱼，下面的目标，一个直立的，固定载物台的落射荧光显微镜。由于鱼的体阻塞光的穿透力，白色和荧光光源必须从以上。上述颅骨腔光纤光源的精心安排让令人满意的明场图像。萤光观看，荧光过滤器规格应匹配的染料的吸收/发射光谱。 切换呼吸到新鲜罐水，并保持相同的流速。暴露的脑腔中，将一根地线连接到地面记录探头（见6.3）。 将旁边的尾根部的一对记录电极，并连接到一个差分放大器和记录装置（ 例如，音频监视器，示波器，或计算机）来监视电器官放电的命令（EODC）。鱼从麻醉中恢复后，EODC可用于作为鱼的情况的一个指标。 准备过的大脑区域在低倍率缩放草图。包括作为地标（可能会有所不同，从鱼到鱼）确定主要血管的确切位置，只有在高倍率下（ 图3D）可见标记的轴突。 确认染料安置。首先查看整个组织方向（与明照明<strong>的图3A）。然后查看荧光照明（ 图3B）。 ELP将有弥漫性标记（ 图3B和3C）。最小化荧光激发的染料，以限制光动力和光毒性作用。 使用地标船只定位在高倍率下的ELA。荧光灯点亮，同时寻找附近的表面标记的轴突。 （ 图4）。 6。记录外活动拉吸的记录电极使用1毫米外径，0.58 mm内径硼硅玻璃毛细管用灯丝。理想针尖大小将取决于目标轴突的直径，这在我们的例子中是0.1-0.2微米17。对于我们的应用程序中，电极尖端直径为1.5±0.4微米（范围1.0-2.4微米），一个长5毫米，窄柄以接近标记轴突不动，周围密密麻麻的组织。 填写电trodes过滤希克曼的振铃器解决方案。最后的的端阻力是45.2±38.0MΩ（范围：16至155MΩ）。 将电极放入一个电极固定器与压力端口和连接到放大器探头安装在机械臂上。运行的压力线压力端口，用于监视和控制压力，一个压力计和一个注射器中的一个丁字路口的结局。 的探头连接到一个放大器和一个模拟 – 数字采集装置。 30毫巴向外的压力在电极线，放置一个电极旁边标记的轴突。吸管放置用于可视化水平低光相机与成像软件接口。组织表面附近，并开始向轴突推进电极。当你接近轴突，向外的压力应引起轻微但明显的运动轴突。 当电极是旁边的轴突（ 图4A，顶部）记录烈性IAL在电极上，而呈现测试刺激（在我们的例子中，我们使用单相100毫秒正面和负面的横向脉冲强度为20 mV /厘米; 图1A）。动作电位不应该得到遵守，，虽然电气神器确认适当的记录/刺激（ 图4A，底部）。 在电极释放的外在压力和重复刺激/记录。仍然无法观察到动作电位（ 图4B）。 轻微（125±25毫巴）吸电极和重复刺激/记录。现在可以观察到动作电位响应的刺激（ 图4C）。自发活动也可能发生。如果没有观察到的动作电位，释放吸力，清除电极轻微的压力，稍微移动电极，然后再尝试吸。一旦动作电位是可见的，关闭的压力线。 刺激和记录需要的话。 7。终止及出售一旦所有想要的录音完成后，切换到100 mg / L的MS-222呼吸已停止，直到EODC。没有EODC应检测至少10分钟。 根据机构指引和认可的动物保健协议处理的鱼。 8。代表结果对于我们的特定的应用程序，大家有兴趣的学习中枢感觉神经元的刺激编码。成功的录音从标记的轴突允许单单元响应分析感官刺激18， 图5A示出了有代表性的动作电位诱发的横向electrosensory刺激用双极电极位于录音室的左侧和右侧壁的内侧。秒杀时间可以穗栅格图（ 图5B）。 25毫秒的预刺激录音风嗷嗷显示低水平的自发活动。这种特殊的ELA“小细胞”，通长调整到6毫伏/厘米的刺激强度，刺激时间增加穗数重复刺激的持续时间增加（ 图5C）。第一穗平均潜伏期为4.28±0.16毫秒，符合预期的延迟小细胞ELA 11。 图1。记录规格的腔室可以容纳的一个固定阶段epiflourescent的显微镜的目标下面（A）要大规模方录音室由有机玻璃示出俯视图，侧视图和后视图。配对套在外围刺激电极（星号）允许横向任一（红黑色）或纵向（蓝色黄色）刺激。一个额外的一块有机玻璃在角落里，用橡胶内衬孔中心（橙色），持有吸吸管，保持恒定的水位。两个立式不锈钢职位室（绿灯）的底部拧入连接到平台支持鱼（浅灰色，在C详述）通过可调光盘夹具不锈钢职位（绿色的轮廓）。照片室到比例图如下所示（B）个人意见和组装的圆形塑料盘夹子用于固定的平台，垂直职位。每个光盘钳拧紧螺丝后的中心孔有一个凹槽（绿色）。光碟夹具旋转，使槽是相互垂直的。拧紧螺丝（红色）夹上岗到位，以防止进一步的垂直和旋转运动的平台（C）正面和侧面规模的有机玻璃平台，用来装鱼到位意见。该平台是涂有一层石蜡（蓝色）保持木有人仍然LS（黑网吧），支持鱼。油管呼吸鱼穿过一个洞，平台两端放置在鱼的嘴在枪头“床头”。的不锈钢头后（灰色条）连接到该平台通过球关节，可以360度旋转。不锈钢卧式职位（绿色）平台的任一端拧入。 点击这里查看大图 。 图2。手术原理概述低头看着背头部表面。（A）4个削减，指示的顺序，取出一块长方形的皮肤（红色）（B）延长开放，前内侧删除一个额外的一块长方形皮肤（绿色）（C）刮去任何剩余的脂肪或韧带移动手术刀按箭头所示的叶片表面完全干燥与KIMWIPES和强制空气（D）胶不锈钢的头骨后，使用超级胶水。在A比例尺适用于AD（E）使用牙钻四个削减，指示的顺序，取出一块长方形的骨（蓝色），露出前方和后方exterolateral的原子核（ELA和ELP，分别）。 点击这里查看大图 。 图3。 3小时后注射葡聚糖共轭的Alexa Fluor 568（A）的前部和后部exterolateral核（ELA和ELP），分别从上述可视化与明视场照明后exterolateral核的荧光标记 。注意ELA广泛的髓鞘内给它一个相对明亮的外观区别于ELP（B）相同的区域可视化使用萤光通过TRITC过滤器查看（C）合并后的图像使用蓝色（明场）和红色为B （TRITC）（D）例ELA和ELP的比例绘图，包括大血管（红色线），可作为地标标识的确切位置，只有在高倍率下可见标记的轴突（血管的确切位置从鱼到鱼）。虚线表示之间的边界ELA和ELP（E）样品采集的图像使用TRITC滤波器的5种不同的制剂，小细胞轴突和胞体的ELA出了一系列成功的标签图案。 图4。单单元外记录从标记的轴突（A）记录电极（箭头）正压下放在相邻的标记小细胞轴突的ELA（顶）在100毫秒20毫伏/厘米的单相，只记录边缘神器的（箭头主管）对侧阳性的，横向的方波脉冲（底部）。（B）的释放，从电极向外的压力（箭头）会导致轴突移动至略微向电极（顶部），但仍存在的刺激没有反应（底部）（ C）轻微负压拉轴突电极（顶部，箭头头）和动作电位响应刺激发病到现在可见的（底部，星号）。所有三种面板的底部覆盖20次重复刺激的反应。 图5。代表性的成果使用这种技术。（A）5个样本的痕迹对侧阳性，横向方波脉冲的刺激。示出由0.1毫秒6毫伏/厘米单相诱发的动作电位，（B）示出穗75毫秒的记录窗口的20次重复相同的单位时间内的栅格图在时间0时的刺激6毫伏/厘米刺激持续时间列在右边的范围（C）量化的响应时间调谐曲线显示在光栅刺激重复穗数。 质量（g） 货叉长度（cm） 身体深度（厘米） 意味着 2.42 6.20 1.14 标准偏差 0.64 0.52 0.18 范围 1.2-4.0 5.5-8.4 0.9-1.6 表1中。最佳鱼的重量，长度和身体深度范围优化重量，货叉长度（吻尖，尾鳍叉）和身体深度（最大背腹在横向平面的距离）范围，让鱼适应在录音室所示图1。鱼太小，可能是不太可能生存了手术，将有一个小的ELP，使染料安置具有挑战性。鱼太大，将有一个大的，过深远的小脑，这将减少ELA和ELP的访问，并可能防止降低高功率，水浸泡的目的ELA和ELP专注于足够接近。 现场报名 染料类型 鱼试图 ELA标签 在ELP标签 试图单位 录音 EL一的Alexa Fluor注射液 32 26（81.2％） 19（59.4％） 50 4（8.0％） ELA Alexa荧光浸泡滤纸 1 0 0 0 0 ELA 狄-I在DMSO中 8 6（75.0％） 0 0 0 ELA 二-O晶体 5 3（60.0％） 2（40.0％） 9 0 ELP 固体的Alexa Fluor晶体 2 0 2（100％） 0 0 ELP 的Alexa Fluor涂层钨丝 43 <strong>的29（67.4％） 41（95.3％） 119 26（21.8％） 表2中。每个染料注射方法的成功率。每个染料注射方法的成功率。方法被划分的基础上，注射部位和染料型。对于每种方法，鱼的总数试图ELA和ELP的成功标记导致这些实验的百分比显示。需要注意的是有针对性的记录区域是申请地点对面的（粗体箱）。对于注射部位，染料吸收被认为是成功的胞体和轴突标签。与此相反，在录制现场，只准备与标记的轴突被算作成功的标记实验。也示企图单位，这些单位的百分比的总数，导致成功的录音。 ＃注射SITES 平均每次注射量（微升） 每次注射量范围（微升） 平均总注射量（微升） 总注入量范围（微升） 汉密尔顿微量 3或4个 0.144 0.091 – 0.91 0.516 0.378 – 0.669 与玻璃吸管Nanoinjector 2 – 4 0.069（固定） 定货量注射1-6倍 0.621 0.414 – 0.966 微量玻璃吸管 2 – 6 0.093 0.058 – 0.202 0.360 0.252 – 0.540 表3中。用于注入铝的三种方法应用的染料的数量时的例子Fluor Alexa荧光用来注入到从表2中的第一种方法（ELA）的三种方法适用于染料成ELA量。染料注入ELA既是nanoinjector和微量使用33号汉密尔顿注射器针头或拉玻璃毛细吸管。不同的注射部位，每次注射的体积和染料注射的总体积数。