Губка поливинилового спирта модели имплантации

1. Губка подготовка Сода губки путем перемешивания в течение ночи в 0,9% (вес / объем) водным раствором хлорида натрия. Стерилизовать гидратированных губки в автоклаве них. За 75 мл, автоклав в течение 25 минут при температуре 121 ° C. Примечание: Загрузка губки с лечением, как описано ниже, не является обязательным. В стерильных капот с стерильных инструментов, выберите один из губки решения с помощью пинцета. Сожмите губкой с пинцетом и использовать вакуумную кончик удалить как можно больше решений, как можно с губкой. Поместите отжатой губкой в ​​чашке культуру ткани, будьте осторожны, чтобы оставить пространство между губками. Несколько пластин и может быть использовано для разделения различных методов лечения. Пипетировать лечение решение непосредственно на центр губкой. Нажмите мягко на губку с пипетки после решения был сделан на губку, это помогает поглощать губка решения. Примечание: 6ммдиаметр на 2,75 мм толщиной губки, которые мы используем в состоянии удерживать более 25 мкл. После того как все губки были загружены, пластины они в могут быть сохранены на льду, пока не будут имплантированы в мышей. 2. Хирургические процедуры Соответственно обезболивания животных и управлять упреждающий анальгетик. Вся процедура длится около 20 минут на одно животное. Для 30 г мышь 1,5 литра в минуту кислорода с 1,5% Изофлюран используется, чтобы вызвать и поддержания анестезии. Когда животное не реагирует на тест щепотку рефлекс, место в носовой конус в положении лежа. Используйте электрическую бритву для бритья 1 дюйма на 1 дюйм площади на нижней брюшной стороне ниже грудной клетки. Протирать среза волос. Стерилизовать побрился области по очистке бетадин затем 70% спиртом. Повторите эту бетадин алкоголя чистки в три раза. Удерживая кожу учил использовать скальпель, чтобы сделать вертикальный разрез в 1,5-2 раза диаметрметр губки должны быть вставлены, быть осторожным, чтобы не прорезать полости тела. Используйте пинцет, чтобы удерживать края кожи и медленно начать разделение кожу от мышц с обеих сторон разреза использованием Metzembaum ножницами. Кармана должны идти по всей ширине мыши и из грудной клетки, чтобы задние лапы. Используйте пинцет, чтобы забрать первую губку, чтобы быть помещены в животное, зажимая его из сторон. Передача губки прямо пинцетом так, чтобы она проходила с верхней и нижней. Используйте пинцет, чтобы удерживать края кожи и снять ее так, чтобы губки могут быть вставлены. Медленно вставьте губка пытается избежать прикосновения к коже или под мышцу, как губка, будет трудно двигаться, когда она коснулась ткани. Повторите эти действия для всех губок. После того как все губки были вставлены, за два или три швов, чтобы закрыть разрез. Используйте пинцет, чтобы удерживать обе стороны от разреза вместе и закрутите Сутуповторно через оба слоя кожи. Затяните первый бросок достаточно, чтобы закрыть кожу края. Закончить квадратный узел с одного броска с другой стороны, на этот раз потянув плотный узел. Затем связать два квадратных узла для завершения шва (рис. 2). Установите дополнительный швов, чтобы закрыть весь разрез. Другие способы связи раны могут быть использованы такие как dermabond, рана клипов, или скоб. Удаление животного из наркоза и мониторинг системы в то время как сознание возобновляется. Животные должны быстро начать ambulating и вернуться к заранее оп мобильности. Убедитесь, что они способны достигать достаточно пищи и воды. Некоторые смоченной пищи могут быть помещены в нижней части клетки для оказания помощи в восстановлении. Продолжайте следить за животным ежедневно в течение признаки бедствия или дискомфорт, и проверить разреза инфекции, воспаления, и зияние. Принимать необходимые меры, если никаких осложнений для восстановления найдено. 3. Дополнительная инъекция <p cдевушка = "jove_content"> Примечание: После того как губки были имплантированы в животных они могут быть введены с решением клеток, препараты, стимуляторы роста и т.д. Это позволяет для анализа последствий введенного вещества во время разнообразных сроков поставки и управления режимов. Если инъекции делаются контроль всегда должны быть использованы. Чтобы придать губкой с искомым решением, в первую очередь определить количество вещества для управления с помощью мыши. Вещество должно быть сосредоточено, так что инъекции объем составляет менее половины от общего объема губка может иметь места. Подготовить шприц для инъекций (для мышей, мы используем 28 G иглой). Поместите животное получает инъекции под наркозом. Когда животное не реагирует на щепотку теста инъекции могут быть предоставлены. Чтобы подтолкнуть инъекции иглу под углом 45 ° тщательного кожи в центре губкой. Затем нажмите на иглу в губку только собирается на полпутипо толщине. Цель состоит в том, чтобы вводить в точном центре губкой. Чтобы проверить, чтобы убедиться, что игла находится в губки, медленно поднимите иглу вертикально. Если стрелка находится в губки, губки должны двигаться с иглы. Медленно введите в губку и удалить иглу. При наличии нескольких губки требуют инъекций, возможно, что некоторые вводят жидкость будет выталкиваться из предыдущих участках инъекций. 4. Губка удаление Примечание: Во время удаления губки, справиться с губкой с дополнительной осторожностью. Избегайте проникновения в губку с хирургическими инструментами и предотвратить чрезмерное кровотечение в губку, избегая крупных артерий вокруг окружающие ткани. После того, как животное усыпляют, удалить губкой, удерживая кожу с помощью пинцета и делая надрез закрыть губкой. Аккуратно отделить губки от окружающих капсулу й избежать сбора дополнительных тканей, окружающих губкой. Для тестов, таких как доставка лекарств или морфометрии, меньшую точность требуется для удаления. 5. Представитель Результаты Удаленные губки могут быть сохранены в различных условиях в зависимости от типа анализа, который будет выполняться. Для секционирования, полученного губки могут быть внедрены в среде для замораживания таких как оптимальная температура резки (ОКТ), соединения или помещены в 10% растворе формалина для встраивания и секционирования в парафиновых блоков (рис. 3А, Б). Наилучшие результаты для резки получаются, когда губка пополам по диаметру и встроенные сократить поверхностью вниз (рис. 4А, Б). Разделы губки должны быть приняты, так что всю ширину губка присутствует. 3А показаны две губки, левая губка была заложена / секционного неправильно и право губка была обработана правильно. ЛОР "> Для анализа, губки могут быть помещены в пробирку Эппендорфа и хранили при -20 ° C до готовности для обработки РНК и количественных реальных губок время ПЦР-анализа должны быть помещены в пробирку Эппендорфа, заморозки и хранить в. – 80 ° C. Кроме того, консервант РНК, такие как RNAlater от QIAGEN, могут быть использованы для стабилизации РНК для безопасного хранения при более высокой температуре. ран жидкость может быть собрана, сжимая губками на трубе, и объединение вместе с жидкостью несколько губки для получения репрезентативной выборки. живые клетки, такие как фибробласты, макрофаги и лимфоциты, также могут быть извлечены из губки. После удаления из животных, губки может быть места в соответствующих средствах массовой информации для нужного типа клеток. Губки может обрабатываться, чтобы освободить клетки физических (т.е. измельчение) или ферментативного (например, коллагеназы) методов. Рисунок 1. ОбезвоживанияТед PVA губка дисков в трех различных размерах. Рисунок 2. Изображение мыши ранозаживляющим модель, показывающая положение боковых раны и четыре PVA губки. Рисунок 3. (A), H & E окрашивания на скорости 4х и (B) трехцветного окрашивания в 10х из секционного парафин губки. Рисунок 4. () Изображение губка разрезать пополам вдоль диаметра. (B) PVA губка 1/2, встроенный разрезанной стороной вниз в октябре