El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo
Summary
Este protocolo de vídeo demuestra un método novedoso para la generación y la posterior purificación de las células progenitoras neuronales de una fuente renovable de células madre neurales (NSC) en base a su físico (granularidad tamaño e interna) y las propiedades fluorescentes utilizando la tecnología de citometría de flujo.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) puede aislarse y ampliado en gran escala, utilizando el ensayo neuroesfera y diferenciado en los tres tipos principales de células del sistema nervioso central (SNC), a saber, los astrocitos, oligodendrocitos y neuronas. Estas características hacen de madre neurales y las células progenitoras de una valiosa fuente renovable de células para estudios in vitro, tales como la detección de drogas, neurotoxicología y electrofisiología y también para la terapia de reemplazo celular en muchas enfermedades neurológicas. En la práctica, sin embargo, la heterogeneidad de la progenie Consejo de Seguridad Nacional, la baja producción de neuronas y oligodendrocitos, y el predominio de los astrocitos después de la diferenciación limitan sus aplicaciones clínicas. Aquí se describe una nueva metodología para la purificación de la generación y posterior de las neuronas inmaduras de la progenie NSC murino utilizando fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de tecnología. Utilizando esta metodología, una población neuronal altamente enriquecido de células progenitoras se puede lograr el ingenioHout cualquier astrocito y la contaminación notable de buena fe Consejo de Seguridad Nacional. El procedimiento incluye la diferenciación de la progenie NSC aislaron y expandieron desde E14 eminencias ratón ganglionares utilizando el ensayo neuroesfera, seguido por aislamiento y enriquecimiento de las células neuronales inmaduras en base a sus propiedades físicas (tamaño y complejidad interna) y fluorescente utilizando la tecnología de citometría de flujo. En general, se tarda 5-7 días para generar neuroesferas y los días 6-8 de diferenciar la progenie Consejo de Seguridad Nacional y aislar altamente purificado las células neuronales inmaduras.
Protocol
Discussion
La capacidad de aislar las poblaciones definidas de células neuronales (neuronas, es decir, astrocitos y oligodendrocitos) podría resolver algunos de los impedimentos asociados con la aplicación clínica de células madre neurales (NSC). En primer lugar, nos permite caracterizar completamente la población a partir de las células del donante. En segundo lugar, nos permite utilizar un tipo de célula particular, o una combinación de diferentes tipos de células con una proporción específica, dependiendo de la natu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.
Materials
| Name of the reagent | Typ | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
Referenzen
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- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
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