Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering
Summary
Een eenvoudige, efficiënte en robuuste manier om de levering van meerdere virale componenten synchroniseren met plantencellen via<em> Agrobacterium</em>-Gemedieerde transiënte expressie beschreven. Deze aanpak is vatbaar voor het bestuderen van replicatie, inkapseling gevolgd door<em> In vitro</em> Montage van niet-virale componenten in het genoom van uitgeput optische virale geesten die geschikt zijn voor biomedische toepassingen.
Abstract
In virussen met een positieve-sense RNA genoom pathogeen zijn voor mens, dier en plant, nageslacht ingepakt in volwassen en stabiel virionen is een kardinale fase tijdens de oprichting van de infectie in een bepaalde host. Bijgevolg, studie van inkapseling ontcijfert de informatie met betrekking tot de know-how van het mechanisme reguleren virus assemblage van infectueuze virionen te vormen. Dergelijke informatie is van vitaal belang bij het formuleren van nieuwe methoden voor het terugdringen van het virus verspreiding van ziekten en plagen. Virus inkapseling kan worden bestudeerd in vivo en in vitro. Genoom inkapseling in vivo is een sterk gereguleerde selectief proces, waarbij macromoleculaire interacties en subcellulaire verkokering. Daarom studie die leidt tot ontleden gebeurtenissen omvat virus inkapseling in vivo zou basiskennis te bieden om te begrijpen hoe virussen zich vermenigvuldigen en te monteren. Onlangs in vitro inkapseling is benut voor het onderzoek op het gebied van biomedische imaGing en therapeutische toepassingen. Niet-omhulde plantenvirussen staan ver vooruit in de onderneming van in vitro inkapseling van de negatief geladen vreemd materiaal. Brome mosaic virus (BMV), een niet-omhulde multicomponent RNA virus pathogeen planten werd gebruikt als modelsysteem voor het bestuderen genoom verpakking in vivo en in vitro. Voor encapsidering assays in Nicotiana benthamiana planten Agrobacterium-gemedieerde transiënte expressie, noemen agroinfiltration, is een efficiënte en robuuste techniek voor de gesynchroniseerde leveren en expressie van meerdere componenten dezelfde cel. In deze benadering wordt een schorsing van Agrobacterium tumefaciens cellen die binair plasmide vectoren die cDNA's van desiredviral mRNA's geïnfiltreerd in de intercellulaire ruimte withina blad met niets meer verfijnd dan een 1 ml wegwerpspuit (zonder naald). Dit leidt tot de overdracht van DNA insert in plantencellen, de T-DNAinsert blijft tijdelijk in de kern en wordt getranscribeerd door de gastheer polymerase II, leiden tot de transiënte expressie. De resulterende mRNA transcript (capped en gepolyadenyleerde) wordt vervolgens geëxporteerd naar het cytoplasma voor de vertaling. Na ongeveer 24 tot 48 uur incubatie, kunnen delen van geïnfiltreerde bladeren worden bemonsterd voor microscopyor biochemische analyses. Agroinfiltration maakt grote aantallen (honderden tot duizenden) cellen gelijktijdig getransfecteerd. Voor in vitro encapsideringssignaal gezuiverd virions van BMV worden gescheiden in capside-eiwit door dialyseren tegen dissociatie buffer met calciumchloride gevolgd door verwijdering van RNA en niet-gedissocieerd virions door centrifugeren. Genoom verarmd capside-eiwit subeenheden vervolgens weer met de gewenste virale genoom onderdelen of niet-virale componenten zoals indocyanine kleurstof.
Protocol
Discussion
Agroinfiltration hier gepresenteerde benadering op grote schaal kunnen worden toegepast op een breed scala van plantenvirussen. Een kenmerk kenmerk van deze benadering is gesynchroniseerd levering van meerdere agroconstruct naar dezelfde cel-een groot nadeel vaak geassocieerd met routinematig mechanische inoculatie van plantenvirussen. In vivo en in vitro studies montage met broom mosaic virus als model kan doelmatig worden uitgevoerd door volgen enkele tips. (i) Voor een succesvolle infiltratie van <e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag een aantal leden van het lab bedanken voor hun waardevolle suggesties in de ontwikkeling van agroinfiltration en in vitro assemblage assays. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Universiteit van Californië. Deze studie werd ondersteund in delen door een subsidie van de National Science Foundation (cbet-1144237).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MES Sodium salts | Sigma-aldrich | M2993 |
| Indocyanine green | Sigma-aldrich | I2633 |
| Beckman ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model: L8-70M |
| Centricon-100 column | Millipore | YM-100 |
| Spectrophotometer | Cary 50, Varian Inc. | Part number 10068900 |
| Spectrofluorometer | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | Part number FL3-21 |
Referenzen
- Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. . Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).
- Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
- Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
- Sambrrok, J., Russel, D. W. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).
- Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
