El CYP2D6 Animal Modelo: cómo inducir a la hepatitis autoinmune en ratones

1. La inyección intravenosa de Ad-2D6 en el seno oftálmica Bajo condiciones estériles, diluir la solución de virus Ad-2D6 imágenes de stock a una concentración de 5 x 10 9 ufp / ml en RPMI y mantener la solución de virus Ad-2D6 en hielo. La inyección de dos dosis de 5 x 10 8 ufp (intravenosa e intraperitoneal) ha demostrado resultar en el resultado más fiable de la hepatitis autoinmune en ratones de la cepa FVB. Anestesie ratón con 4% de isoflurano en una cámara de anestesia. Apriete la pata trasera para asegurarse de que el animal está anestesiado. Mantenga el ratón por la parte posterior del cuello y apretar la piel suelta de la cabeza con el pulgar y el dedo medio. ¿Te gusta esta, el ojo sobresale ligeramente por la tracción a la piel adyacente al ojo. Coloque la aguja verticalmente en el canto medial (unión de los párpados más cercanos a la nariz del animal) e inyecte lentamente 100 l Ad-2D6 solución de virus. Es importante no aplicar demasiada presión, aevitar el daño de los vasos y la tráquea. Lentamente retire la aguja para evitar el derrame y cerrar los párpados. Inyección funcionado bien, si la solución de virus no se filtra a través de la nariz y el ojo se desliza hacia atrás a su posición inicial. Inmediatamente después de la inyección intravenosa, realice una inyección estándar intraperitoneal de la segunda 100 l de la solución de virus Ad-2D6. Alternativamente, la inyección intravenosa puede ser ejecutado a través de la vena de la cola. Sin embargo, la inyección a través del seno oftálmica es mucho más fácil de realizar y minimiza la pérdida de solución de virus. Se ha demostrado que estas dos técnicas se pueden utilizar indistintamente y que ambas rutas son igualmente eficaces 10. Los ratones infectados son supervisados ​​por los efectos adversos y los signos evidentes de sufrimiento y el dolor, tales como pérdida de apetito, pérdida de peso, pérdida de la movilidad, la falta de novio, pelo áspero, encorvadola apariencia, así como lamer, morder, arañar, o sacudir a un área en particular (es decir, el sitio de la inyección). Aunque los ratones muestran un daño masivo en el hígado en el modelo de CYP2D6, los ratones parecen estar sanos y no muestran signos de sufrimiento, el dolor o el estrés. Sin embargo, los indicadores de insuficiencia hepática grave, como las aminotransferasas séricas están determinados sobre una base regular o son parte de los experimentos realizados. Los niveles de aminotransferasa de> 1000 U / l sólo debe aparecer como un resultado directo de la infección por el virus, pero no crónica. Si los niveles de aminotransferasas séricas están crónicamente por encima de 1000 U / l (límite de la gravedad) se sacrifican los ratones. 2. Ratón sangrado en el ojo Anestesie ratón con 4% de isoflurano en una cámara de anestesia. Apriete la pata trasera para asegurarse de que el animal está anestesiado. Mantenga el ratón por la parte posterior del cuello y apretar la piel suelta de la cabeza con el pulgar y el dedo medio. De esta manera, el ojo sobresale ligeramente porla tracción a la piel adyacente al ojo. Coloque la punta del tubo capilar en la esquina inferior o interior del ojo y suavemente pero con firmeza se deslizó junto al globo ocular para el seno venoso oftálmico. La ruptura de los capilares venosos y la hemorragia resultante se llena la cavidad orbitaria. Ligeramente retirar el tubo capilar para liberar la punta de modo que la sangre acumulada se dibuja en el tubo. Cuando hay suficiente sangre recolectada, el tubo se retira y cerró los párpados. El sangrado se detiene tras la retirada del tubo y restablecimiento de la presión ocular normal sobre el complejo venoso. Sangre en el tubo capilar se transfiere a un tubo Microtainer y se incubaron durante 30 min en hielo. El tubo Microtainer se centrifuga a 7500 xg durante 2 min a 4 ° C. El sobrenadante se corresponde con el suero que se transfiere a un tubo nuevo y se almacenó a -80 ° C. Suero se puede utilizar para determinar título de anticuerpos por ELISA. Indicares de daño hepático, como los niveles séricos de las enzimas hepáticas alanina aminotransferasa (ALT / GPT) y la aspartato aminotransferasa (AST / GOT) se puede evaluar utilizando las tiras de prueba de acuerdo de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania) y un analizador de Reflotron Plus ( Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Como alternativa, tomar muestras de sangre se puede hacer a través de la vena de la cola o por medio de la vena temporal superficial 11. 3. Ratón perfusión del hígado Observación: Este paso es importante para evitar una contaminación de los linfocitos hepáticas aisladas por linfocitos de sangre La eutanasia de los ratones por dosis letales de CO 2, seguido por dislocación cervical. Montar el animal apoyado en la espalda a la junta de espuma de poliestireno. Use agujas de 23 G para fijar las extremidades. Hidrata y desinfectar el ratón con el 70% de EtOH Alrededor de 1 cm de distancia de las patas traseras, hacer una incisión a través dela piel y la capa muscular. Cortar en ambos lados de el animal de trabajo hasta el diafragma. Cuando el diafragma se alcanza la piel puede ser volteado al revés. Cortar la membrana lejos de los rasgones a continuación, cortar la vena cava. Mueva el estómago y los intestinos a un lado, exponiendo la vena porta. En la vena porta inserto una aguja 27 G conectada a una jeringa de 5 ml llena con PBS frío. Deje que el PBS lentamente lavar la sangre fuera del hígado. Disecar el hígado por el acaparamiento hacia el diafragma y corte el diafragma lejos del cuerpo. Transferir el hígado a una caja de petri y retirar el diafragma, la vesícula biliar y cualquier otro tejido sigue conectado al hígado Transferir el hígado a 10 ml de PBS en un tubo de 50 ml en hielo o incrustar en el complejo de octubre 4. Aislamiento de linfocitos hepáticos Prepare las siguientes soluciones madre: Colagenasa IV de valores (100 mg / ml) in PBS. (Haga pequeñas alícuotas y almacenar a -20 ° C). DNasa imágenes de stock (25 mg / ml) en PBS. (Haga pequeñas alícuotas y almacenar a -20 ° C). Colagenasa búfer: PBS que contenía 0,2 mg / ml de colagenasa IV, 0,02 mg / ml de DNasa y 5% de FCS; para 1 hígado, mezclar 9,5 ml de helado de PBS, 20 l IV colagenasa (100 mg / ml de imágenes de stock), 8 l DNasa ( 25 mg / imágenes de stock ml), y 500 l de FCS inactivado por calor. 35% de Percoll, mezclar 175 ml de Percoll, 20 ml de 10 x PBS de valores; 305 ml de PBS. RPMI completo = RPMI que contiene 10% FCS inactivado por calor, μ 100 / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina. Transferir el hígado perfundido (ver sección 3) y 10 ml de PBS fresco en una placa de Petri en el hielo y cortar en trozos pequeños con unas tijeras. Traslado en un colador micras 70 celular y juncos exprimibles hígado a través con una mano de mortero de vidrio o de una mano de mortero desde una jeringa de 2 ml. Añadir con cuidado 10 ml de tampón de colagenasa frío yprensa a través del filtro. Recoger suspensión y filtro a través del colador dos veces más. Transfiera la suspensión a tubo nuevo de 50 ml en hielo. Al hígado a procesar el próximo. Incubar la suspensión de células hepáticas a 37 ° C durante 60 minutos, mezcle suavemente cada 15 minutos. Centrifugar a 30 xg durante 3 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo fresco, dejando 5 fluido mm por encima de pellets Centrifugar a 650 xg durante 10 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante, dejando 3 mm por encima de pellets Resuspender el precipitado en 20 ml de tampón Percoll Centrifugar a 600 xg durante 20 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y el precipitado volver a suspender por el parpadeo del tubo. Lavar pellet 1 x con PBS. Lavar pellet con 1 x completo RPMI Resuspender el sedimento en 3 ml de RPMI completo y recuento de células en una dilución de 1:10. Resuspender las células en ~ 10 7 células / ml en RPMI completo y transferir el tubo en hielo. </ol> 5. Tinción intracelular de citoquinas (CIEC) 5.1 Estimulación: Preparar los linfocitos del hígado a ~ 10 7 células / ml en RPMI completo como se ha descrito. Placa de 100 l (10 6 células) / pocillo en una placa plana de 96, así que no es de cultivo de tejidos tratados. Añadir 50 l de RPMI completo que contiene 2μg/ml Brefeldina A y luego añadir 50 l de RPMI completo que contiene 2 mg / ml de péptido estimular CYP2D6 (por ejemplo, las células CD4 inmunodominantes epítopo CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 o el epítopo inmunodominante CD8 CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Mezclar por pipeteo. Incubar durante 5 horas a 37 ° C (tiempo de estimulación óptima, pero incubación durante la noche funciona tan bien). 5,2. Manchas: Prepare las siguientes soluciones madre: Tampón FACS: PBS con 1% de ternera fetal sErum (FCS). Fijación / permeabilización de amortiguación: FACS tampón que contiene saponina 0,1% y el 4% de paraformaldehído FACS / saponina tampón de lavado: FACS tampón que contiene 0,1% de saponina FACS / PFA búfer: FACS tampón que contiene 1% de paraformaldehído (PFA) Transfiera las células en placa de microtitulación con fondo en V (96-bien) y girar a 460 xg durante 3 min a 4 ° C. Deseche medio y placa de vórtice Añadir 150 l de tampón FACS y centrifugar a 460 g durante 3 min a 4 ° C. Deseche mediano y placa de vórtice. Repita el paso de lavado. Bloquear FcR superficie si es necesario (cuando se utiliza anticuerpos secundarios) con 1 g / ml αCD16/32 cóctel (bloque FcR) en tampón FACS durante 15 min a 4 ° C y se lavan con 2 x 150 tampón de tinción l (460 xg durante 2 min a 4 ° C). Stain para moléculas de superficie: es decir, anti-CD8a-FITC AcMo 10 ug / ml en 50 tampón FACS l durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad. Añadir 100 l FACStampón y el giro a 460 g durante 3 min a 4 ° C. Lavar las células 2 x con 150 tampón FACS l (460 xg; 3 min; 4 ° C). Vortex plato. Fijar / permeabilizar las células con 100 l de fijación / permeabilización de amortiguación durante 10 min a temperatura ambiente. Gira a 460 g durante 7 min a 4 ° C. Tenga en cuenta que es importante para extender el tiempo de centrifugación a 7 min, ya que la fijación / pasos permeabilzation cambia la densidad global de las células. Vortex plato. Lavar con 2 x 150 l / FACS buffer de lavado de saponina (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plato. Manchas de moléculas intracelulares, es decir anti-IFN-PE MAB 10 mg / ml en 50 l / FACS buffer de lavado saponina durante 30 min a 4 ° C. Añadir 100 l / FACS tampón de lavado y centrifugado saponina a 460 g durante 7 min a 4 ° C. Lavar las células con 2 x 150 l / FACS buffer de lavado de saponina (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plato. Lavar las células con 1 x tampón FACS (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex plato. </li> Resuspender las células en 200 l / PFA FACS de amortiguamiento, la transferencia en los tubos, y se almacena a 4 ° C en la oscuridad hasta la adquisición de datos por citometría de flujo. Normalmente utilizamos un FACSCanto II o un FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). 6. La inmunohistoquímica 6,1. H & E tinción para la evaluación de la patología general del hígado: Cosecha del hígado, inmerso en Tissue-Tek octubre en un molde de base disponible y rápida por congelación en hielo seco. Corte 7 micras secciones de tejido del hígado usando un criostato Leica fijado en -17 ° C y montar los cortes de tejido en Superfrost Plus portaobjetos de microscopio. Tienda de diapositivas a -20 ° C hasta su uso posterior. Fijar cryosections en pre-enfriado EtOH durante 15 minutos a -20 ° C. Deje secar durante 10 minutos. Lavar 2 x en agua destilada durante 2 min a temperatura ambiente (los siguientes pasos, 6.1.5 – 6.1.13, se llevan a cabo a temperatura ambiente). Teñir con solución de hematoxilina de Meyer8 min. Lave en agua tibia (30 ° C) el agua del grifo durante 10 minutos. Cambiar el agua varias veces. Enjuague con agua destilada. Enjuague con EtOH al 95% durante 20 segundos. Contratinción en Eosina G / Y la solución durante 40 segundos. Deshidratar 2 x en 95% EtOH durante 5 min por incubación. Deshidratar 2 x en 100% EtOH durante 5 min por incubación. Aclarar en xileno de 2 x 5 min por compensación. Montar en Roti-Histokitt. 6,2. La inmunohistoquímica para la deposición de colágeno I: Cosecha del hígado, sumergirse en Tissue-Tek octubre en un molde base de desechable y rápida por congelación en hielo seco. Corte 7 micras secciones de tejido del hígado usando un criostato Leica fijado en -17 ° C y montar los cortes de tejido en Superfrost Plus portaobjetos de microscopio. Tienda de diapositivas a -20 ° C hasta su uso posterior. Fijar cryosections en EtOH frío durante 15 minutos a -20 ° C. Deje secar durante 10 minutos. Lavar 2 x en PBS durante 2 min a temperatura ambiente. <li> Incubar en PBS que contenía 0,3% de H 2 O 2 y 0,1% de Na-azida durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar 2 x en PBS durante 2 min a temperatura ambiente. Bloque con un kit de avidina-biotina bloqueo según las instrucciones del fabricante. Bloquee con 10% de FCS en PBS (FCS / PBS) durante 30 min a temperatura ambiente. El anticuerpo primario es un conejo anti-ratón colágeno anticuerpo I que se diluyó 1:200 en 10% de FCS / PBS. Incubar secciones con el anticuerpo primario durante 2 horas a temperatura ambiente. Lávese las secciones 3 x en PBS durante 4 min a temperatura ambiente. Diluir biotinilado anti-conejo de anticuerpos a 1:500 y se incuba con las secciones correspondientes a 1,5 hr a temperatura ambiente. Lávese las secciones 3 x en PBS durante 4 min a temperatura ambiente. Color de la reacción se obtiene por incubación secuencial con conjugado avidina-peroxidasa y diaminobencidina-peróxido de hidrógeno según las directrices del fabricante. Contratinción de Meyer Élsolución matoxylin durante 5 min, lave 2 x en PBS durante 2 min a temperatura ambiente y montar en Aquatex. 7. Los resultados representativos La infección de ratones con 2D6 Ad-inducidos por dos etapas distintas de daño hepático. En los primeros días después de la infección, la infección por el virus del hígado provoca un aumento agudo de los niveles séricos de aminotransferasa, un indicador de la muerte de los hepatocitos 6. Esta primera etapa, aguda se produce independiente de la expresión de hCYP2D6 y también se puede observar después de la infección con un virus de control vacía (Ad-Control) o un virus que expresaba la proteína de fluorescencia verde (Ad-GFP). En contraste, la segunda etapa es autoinmune mediada y depende de la expresión de la molécula de activación hCYP2D6. Esta etapa autoinmune se produce dentro de 2-4 semanas después de la infección y persiste durante varios meses, 6. <p class = "jove_content"> Figura 1. El modelo de CYP2D6. Wildtype FVB o C57BL / 6 ratones son inyectados con dos dosis de la Ad-2D6 (por vía intravenosa e intraperitoneal). En un momento de interés en el hígado y el suero se recopilan y evalúan los daños del hígado y la formación de hCYP2D6 específicos de anticuerpos y células T. Las siguientes características son característicos de la hepatitis autoinmune persistentes en desarrollo después de Ad-2D6-infección de tipo salvaje o FVB ratones C57BL / 6 en el modelo de CYP2D6: en primer lugar, el hígado muestra una morfología aberrante cambiado. En particular, los lóbulos del hígado se funden, los nódulos hiperplásicos aparecen dispersos por todo el hígado y la fibrosis capsular masiva es visible (figura 2). Figura 2. La morfología del hígado. Típica Ad-2D6-inducida por daño en el hígado como se detectó en la semana 4 después de la infección. Tenga en cuenta que los lóbulos del hígado individuales se fusionan (puntas de flecha). Nódulos hiperplásicos aparecen dispersos por todo el hígado (flechas). La infección con un adenovirus control no expresando hCYP2D6 no tiene ningún efecto sobre la morfología del hígado. Infiltraciones celulares segundo lugar, una amplia y persistente aparecen en las regiones peri-portal y del parénquima de los hígados de los ratones Ad-2D6-infectados, pero no de Ad-Control infectado (figura 3A). La fibrosis predominantemente desarrolla en la región subcapsular con algunos haces de colágeno que sobresalen en el parénquima (figura 3B). Figura 3. A la histología hepática. Tinción H & E de la sección de tejido hepático de los ratones FVB infectadas con Ad-control o Ad-2D6 en la semana 4 post-infección. Tenga en cuenta que las infiltraciones importantes de las células mononucleares sólo están presentes en Ad-2D6 ratones infectados (flechas simples). Flechas indican Triple grandes infiltraciones celulares en el parénquima hepático de puente entre vecinos tractos portales. B: Representación inmunohistoquímica de la fibrosis hepática en la semana 4 después de la infección con Ad-2D6 o Ad-control. Las secciones del hígado han sido teñidos para colágeno utilizando un anticuerpo anti-colágeno I. Nota capa múltiple de disposición colágeno bajo la cápsula del hígado (flechas triples) con algunos manojos que sobresalen en el parénquima (flechas simples) y la presencia de grandes racimos de células infiltrantes (puntas de flecha). Dos secciones de hígado representativas se muestran para cada condición. Tamaño: 100 micras bares. Una tercera característica es la generación de altos títulos de anti-CYP2D6 anticuerpos, que tienen una especificidad epítopo similar a humanos LKM-1 anticuerpos 6,13. Último, las hCYP2D6 específicos de células CD4 y CD8 T que se generan sobre todo en casa para el hígado. Tales hCYP2D6 específicos de las células T pueden ser detectados por la estimulación con immunodomiembarazadas hCYP2D6 péptidos y posterior medición de la expresión de IFN por una tinción intracelular de citoquinas (ICCS) (figura 4). hCYP2D6-específicas las células T CD8 matar Ad-2D6-infectados células diana in vivo 12. Figura 4. hCYP2D6 células T específicas. análisis de citometría de flujo de las células T específicas de hCYP2D6. Linfocitos del hígado han sido aislados en la semana 4, después de Ad-2D6-infección y se estimularon con cualquiera de los CD4 o CD8 inmunodominantes hCYP2D6 epítopo durante la noche. Generación de IFN fue detectada por tinción intracelular de citoquinas y analizadas por citometría de flujo utilizando un FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). El porcentaje de hCYP2D6-específicas células CD4 y CD8 está indicado.