Il CYP2D6 modello animale: come indurre epatite autoimmune in topi

1. L'iniezione endovenosa di Ad-2D6 in seno oftalmica In condizioni sterili, diluire il Ad-2D6 soluzione stock di virus ad una concentrazione di 5 x 10 9 pfu / ml in RPMI e mantenere l'Ad-2D6 soluzione antivirus su ghiaccio. Iniezione di due dosi di 5 x 10 8 PFU (endovenosa e intraperitoneale) ha dimostrato di comportare il risultato più affidabile di epatite autoimmune in topi del ceppo FVB. Anestetizzare il mouse con il 4% isoflurano in una camera di anestesia. Pizzicare la zampa posteriore per assicurarsi che l'animale è stato anestetizzato. Tenere il mouse la parte posteriore del collo e stringere la pelle flaccida della testa con il pollice e il dito medio. Piace questa, l'occhio sporge leggermente dalla trazione alla pelle adiacente all'occhio. Posizionare l'ago verticalmente nel canto mediale (bivio di palpebre più vicini al naso dell'animale) e iniettare lentamente 100 ul Ad-2D6 soluzione di virus. E 'importante non applicare troppa pressione, perevitare il danneggiamento dei vasi e la trachea. Estrarre lentamente l'ago per evitare la fuoriuscita e chiudere le palpebre. Iniezione funzionato bene se la soluzione virus non fuoriesca attraverso il naso e l'occhio scorre all'indietro sua posizione iniziale. Subito dopo l'iniezione endovenosa, eseguire una iniezione standard intraperitoneale del secondo 100 pl di Ad-2D6 soluzione di virus. In alternativa, l'iniezione endovenosa può essere eseguita attraverso la vena della coda. Tuttavia, iniezione tramite il seno oftalmica è molto più facile da eseguire e minimizza la perdita di soluzione virus. È stato dimostrato che queste due tecniche possono essere utilizzati in modo intercambiabile e che entrambe le vie sono ugualmente efficaci 10. Topi infetti vengono monitorati per gli effetti avversi e segni evidenti di sofferenza e di dolore, come la perdita di appetito, perdita di peso, perdita di mobilità, il mancato sposo, pelo ruvido, curvoaspetto, così come leccare, mordere, graffiare, o agitando una particolare area (ad esempio il sito di iniezione). Anche se i topi visualizzare un danno enorme al fegato nel modello CYP2D6, i topi sembrano sani e non mostrano segni di sofferenza, dolore o stress. Tuttavia, gli indicatori di insufficienza epatica grave, come aminotransferasi sierica sono determinati su base regolare o fanno parte degli esperimenti effettuati. I livelli sierici di transaminasi> 1000 U / l deve apparire come un risultato diretto della infezione da virus, ma non cronicamente. Se i livelli sierici di transaminasi sono cronicamente di sopra di 1000 U / l (limite di gravità) i topi vengono sacrificati. 2. Mouse occhio sanguinamento Anestetizzare il mouse con il 4% isoflurano in una camera di anestesia. Pizzicare la zampa posteriore per assicurarsi che l'animale è stato anestetizzato. Tenere il mouse la parte posteriore del collo e stringere la pelle flaccida della testa con il pollice e il dito medio. Piace questa, l'occhio sporge leggermente dala trazione alla pelle adiacente all'occhio. Posizionare la punta del tubo capillare nell'angolo inferiore o interno dell'occhio e delicatamente ma con fermezza, scivolò lungo il bulbo oculare al seno venoso oftalmico. La rottura capillari venosi e l'emorragia conseguente riempie la cavità orbitale. Leggermente ritirare il tubo capillare per liberare la punta in modo che il sangue accumulato viene disegnata nel tubo. Quando il sangue viene raccolto a sufficienza, il tubo viene ritirato e le palpebre chiuse. Il sanguinamento si ferma al momento della revoca del tubo ed il ripristino della pressione oculare normale, sul complesso venoso. Sangue nel tubo capillare viene trasferito ad un tubo Microtainer e incubate per 30 min in ghiaccio. Il tubo Microtainer viene centrifugato a 7500 xg per 2 min a 4 ° C. Il supernatante corrisponde al siero che viene trasferita ad un tubo fresco e conservati a -80 ° C. Siero può essere usato per determinare il titolo anticorpale da ELISA. Indicatori di danno epatico, come i livelli sierici degli enzimi epatici alanina aminotransferasi (ALT / GPT) e aspartato aminotransferasi (AST / GOT) può essere valutato utilizzando le strisce reattive secondo da Roche Diagnostics (Mannheim, Germania) e un analizzatore Reflotron plus ( Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). In alternativa, il prelievo di sangue può essere fatto attraverso la vena della coda o tramite la vena temporale superficiale 11. 3. Fegato di topo perfusione Nota: Questo passo è importante per evitare una contaminazione dei linfociti epatiche isolate da linfociti del sangue Euthanize il mouse da dosi letali di CO 2 seguite da dislocazione cervicale. Montare l'animale, che sulla sua schiena sul bordo polistirolo. Usare aghi da 23 G al pin estremità. Idratare e disinfettare il mouse con il 70% EtOH Circa 1 cm di distanza da zampe posteriori, fare un'incisione attraversola pelle e lo strato muscolo. Tagliare su entrambi i lati dell'animale lavorativi fino al diaframma. Quando il diaframma viene raggiunto il pelle può essere capovolte all'indietro. Tagliare il diaframma lontano dalle strappa poi tagliare la vena cava. Spostare lo stomaco e gli intestini di lato, esponendo la vena porta. Nella vena porta inserire un ago 27 G collegato ad una siringa da 5 ml riempita con PBS freddo. Lasciate che il PBS lentamente lavare il sangue fuori del fegato. Dissect il fegato afferrando sul diaframma e tagliando il diaframma lontano dal corpo. Trasferire il fegato a un capsula petri e rimuovere il diaframma, la colecisti e qualsiasi altro tessuto ancora collegato al fegato Trasferire il fegato per 10 ml PBS in una provetta da 50 ml su ghiaccio o incorporare in mescola ottobre 4. Isolamento dei linfociti del fegato Preparare le soluzioni madre seguenti: Collagenasi IV stock (100 mg / ml) in PBS. (Make piccole aliquote e conservare a -20 ° C). DNasi stock (25 mg / ml) in PBS. (Make piccole aliquote e conservare a -20 ° C). Collagenasi buffer: PBS contenente 0,2 mg / ml collagenasi IV, 0,02 mg / ml DNasi e il 5% FCS, per 1 fegato, miscelare 9,5 ml ghiacciata PBS, 20 pl collagenasi IV (100 mg / ml stock), 8 microlitri DNase ( 25 mg / archivio di ml), e 500 pl FCS inattivato al calore. Percoll 35%; mix 175 ml Percoll, 20 ml 10 x PBS stock; 305 ml di PBS. RPMI completo = RPMI contenente il 10% FCS inattivato al calore, 100 μ / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 2 mM L-glutammina. Trasferire il fegato perfuso (vedi sezione 3) a 10 ml di PBS fresco in una capsula di Petri su ghiaccio e tagliato in piccoli pezzi con le forbici. Trasferire in un colino 70 micron delle cellule del fegato e giunche passare attraverso con un pestello di vetro o un pestello da una siringa da 2 ml. Aggiungere con cautela 10 ml di buffer collagenasi freddo ePassare attraverso il filtro. Raccogliere la sospensione e filtrare attraverso il filtro due volte di più. Trasferimento sospensione fresca tubo da 50 ml su ghiaccio. Processo fegato successivo. Incubare sospensione cellulare del fegato a 37 ° C per 60 min, mescolare delicatamente ogni 15 min. Centrifugare a 30 xg per 3 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, lasciando 5 fluido mm sopra pellet Centrifugare a 650 xg per 10 min a 4 ° C. Gettare il surnatante, lasciando 3 mm sopra il pellet Risospendere il pellet in 20 ml di Percoll tampone Centrifugare a 600 xg per 20 min a 4 ° C. Gettare il surnatante e risospendere pellet muovendo il tubo. Lavare 1 x pellet con PBS. Lavare pellet 1 x con un completo RPMI Risospendere il pellet in 3 ml RPMI completare e contare le cellule in una diluizione 1:10. Risospendere le cellule a ~ 10 7 cellule / ml in RPMI completare e trasferire tubo al ghiaccio. </ol> 5. Citochine colorazione intracellulare (ICCS) 5,1 stimolazione: Preparare linfociti fegato a ~ 10 7 cellule / ml in completa RPMI come descritto. Piastra 100 pl (10 6 celle) / bene in un piatto da 96 pozzetti, che non è un tessuto-coltura trattata. Aggiungere 50 microlitri RPMI completare contenente 2μg/ml brefeldina A e quindi aggiungere 50 pl RPMI completo contenente 2 ug / ml stimolando CYP2D6 peptide (cioè le CD4 immunodominanti epitopo CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 o il immunodominante CD8 epitopo CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Miscelare pipettaggio. Incubare per 5 ore a 37 ° C (tempo di stimolazione ottimale, ma una notte di incubazione funziona pure). 5,2. Colorazione: Preparare le soluzioni madre seguenti: FACS tampone: PBS contenente 1% di vitello fetale serum (FCS). Fissaggio / permeabilizzazione buffer: FACS tampone contenente saponina 0,1% e il 4% paraformaldeide FACS / saponina tampone di lavaggio: FACS tampone contenente 0,1% di saponina FACS / PFA buffer di: FACS tampone contenente 1% paraformaldeide (PFA) Trasferire le cellule in fondo a V micropiastre (96 pozzetti) e girare a 460 xg per 3 min a 4 ° C. Eliminare medio e piastra di vortex Aggiungere 150 tampone microlitri FACS e centrifugare a 460 xg per 3 min a 4 ° C. Eliminare media e la piastra di vortice. Ripetere la fase di lavaggio. Block FcR superficie se è necessario (quando si utilizza anticorpi secondari) con 1 pg / ml αCD16/32 cocktail (blocco FcR) in tampone FACS per 15 min a 4 ° C e lavare 2 x con 150 tampone colorazione microlitri (460 xg per 2 min a 4 ° C). Colorazione per molecole di superficie: ie Anti-CD8a-FITC mAb 10 ug / ml in 50 tampone microlitri FACS per 30 min a 4 ° C al buio. Aggiungere 100 FACS pltampone e centrifuga a 460 xg per 3 min a 4 ° C. Lavare le cellule 2 x con 150 tampone microlitri FACS (460 xg; 3 min; 4 ° C). Vortex piastra. Fix / permeabile cellule con 100 microlitri di fissaggio / permeabilizzazione buffer per 10 min a RT. Spin a 460 xg per 7 min a 4 ° C. Si noti che è importante estendere il tempo di centrifugazione per 7 min, poiché la fissazione / passi permeabilzation cambia la densità complessiva delle cellule. Vortex piastra. Lavare con 2 x 150 FACS pl / tampone di lavaggio saponina (460 xg, 7 min, 4 ° C). Vortex piastra. Colorare per molecole intracellulari: cioè Anti-IFNy-PE mAb 10 mg / ml in 50 FACS pl / tampone di lavaggio saponina per 30 min a 4 ° C. Aggiungi 100 FACS pl / tampone di lavaggio saponina e spin a 460 xg per 7 min a 4 ° C. Lavare le cellule 2 x con 150 FACS pl / tampone di lavaggio saponina (460 xg; 7 min; 4 ° C). Vortex piastra. Lavare le cellule 1 x con FACS tampone (460 xg; 7 min; 4 ° C). Vortex piastra. </li> Risospendere le cellule in 200 FACS pl / PFA buffer, il trasferimento in provette, e conservare a 4 ° C al buio fino alla acquisizione dei dati mediante citometria di flusso. Noi normalmente si usa uno II FACSCanto o un FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Germania). 6. Immunoistochimica 6,1. Colorazione H & E per la valutazione della patologia del fegato generale: Harvest fegato, immergere in Tissue-Tek ottobre in uno stampo di base usa e getta e quick-freeze in ghiaccio secco. Tagliare 7 um sezioni di tessuto di fegato utilizzando un criostato Leica fissato a -17 ° C e montare le sezioni di tessuto su Superfrost Plus. vetrini da microscopio. Conservare i vetrini a -20 ° C fino ad ulteriore utilizzo. Fix criosezioni in pre-raffreddata EtOH per 15 min a -20 ° C. Lasciare asciugare per 10 min. Lavare 2 x in acqua distillata per 2 min a temperatura ambiente (i seguenti passaggi, 6.1.5 – 6.1.13, vengono eseguite a temperatura ambiente). Colorare con soluzione ematossilina Meyer per8 min. Lavare in acqua calda (30 ° C) l'acqua del rubinetto per 10 minuti. Cambiare acqua più volte. Sciacquare con acqua distillata. Sciacquare in EtOH 95% per 20 sec. Di contrasto in Eosina G / Y soluzione per 40 sec. Disidratare 2 x in 95% EtOH per 5 min per incubazione. Disidratare 2 x in EtOH al 100% per 5 min per incubazione. Cancella in xilene 2 x per 5 min per compensazione. Montare in Roti-Histokitt. 6,2. Immunoistochimica per la deposizione di collagene I: Fegato Harvest, immergerà in Tissue-Tek ottobre in uno stampo di base usa e getta e quick-freeze in ghiaccio secco. Tagliare 7 um sezioni di tessuto di fegato utilizzando un criostato Leica fissato a -17 ° C e montare le sezioni di tessuto su Superfrost Plus. vetrini da microscopio. Conservare i vetrini a -20 ° C fino ad ulteriore utilizzo. Fissare criosezioni in freddo EtOH per 15 min a -20 ° C. Lasciare asciugare per 10 min. Lavare 2 x in PBS per 2 min a temperatura ambiente. <li> Incubare in PBS contenente 0,3% H 2 O 2 e 0,1% Na-azide per 10 min a temperatura ambiente. Lavare 2 x in PBS per 2 min a temperatura ambiente. Blocco con un avidina-biotina kit di bloccaggio secondo le linee guida del produttore. Blocco con 10% FCS in PBS (FCS / PBS) per 30 min a temperatura ambiente. L'anticorpo primario è un anticorpo anti-topo di coniglio collagene I che viene diluito 1:200 in 10% FCS / PBS. Incubare le sezioni con anticorpo primario per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 x in PBS per 4 min a temperatura ambiente. Diluire biotinilato anti-coniglio anticorpo a 1:500 e incubare con le sezioni per 1,5 hr a temperatura ambiente. Lavare le sezioni 3 x in PBS per 4 min a temperatura ambiente. Reazione Colore è ottenuta tramite incubazione sequenziale con avidina-perossidasi coniugato e diaminobenzidina-perossido d'idrogeno secondo linee guida del produttore. Di contrasto in Meyer hamatoxylin soluzione per 5 minuti, lavare 2 x in PBS per 2 minuti a temperatura ambiente e montare in Aquatex. 7. Risultati rappresentativi L'infezione di topi con Ad-2D6 indotte da due fasi distinte di danno epatico. Nei primi giorni dopo l'infezione, infezione virale del fegato provoca un aumento acuto dei livelli sierici di transaminasi, un indicatore della morte degli epatociti 6. Questa prima, fase acuta si verifica indipendente della espressione di hCYP2D6 e possono anche essere osservati dopo infezione con un virus controllo vuota (Ad-Control) o un virus che esprime proteina verde fluorescenza (Ad-GFP). In contrasto, il secondo stadio è autoimmune-mediata e dipendente dalla espressione della molecola innesco hCYP2D6. Questa fase autoimmune si verifica entro 2-4 settimane dopo l'infezione e persiste per diversi mesi 6. <p class = "jove_content"> Figura 1. Il modello CYP2D6. Tipo selvatico FVB o C57BL / 6 topi iniettati con due dosi di Ad-2D6 (per via endovenosa e intraperitoneale). In un momento di interesse del fegato e il siero vengono raccolti e valutati per danni al fegato e formazione di hCYP2D6-specifici anticorpi e cellule T. Le seguenti caratteristiche sono caratteristiche di epatite autoimmune persistente si sviluppa dopo Ad-2D6-infezione di tipo selvatico o FVB C57BL / 6 topi nel modello CYP2D6: in primo luogo, il fegato presenta una morfologia aberrante cambiato. In particolare, i lobi epatici sono fusi, noduli iperplasici appaiono sparsi tutto il fegato e una fibrosi capsulare massiccia è visibile (figura 2). Figura 2. Morfologia del fegato. Tipico Ad-2D6-indotto danni al fegato come rilevato a 4 settimane dopo l'infezione. Si noti che i lobi del fegato singoli si fondono (punte di freccia). Noduli iperplasico appaiono sparsi tutto il fegato (frecce). Infezione con un adenovirus controllo non esprimendo hCYP2D6 ha alcun effetto sulla morfologia fegato. Infiltrazioni cellulari secondo luogo, esteso e persistente appaiono nelle regioni peri-portale e parenchimale di fegato di topi Ad-2D6-infetti, ma non Ad-Control-infetti (figura 3A). Fibrosi sviluppa prevalentemente nella regione sottocapsulare con alcuni fasci di collagene sporgenti nel parenchima (figura 3B). Figura 3. Istologia epatica A:. Colorazione H & E della sezione di tessuto epatico di topi FVB infettati sia con Ad-Control o Ad-2D6 a 4 settimane dopo l'infezione. Si noti che significative infiltrazioni di cellule mononucleate sono presenti solo in Ad-2D6 topi infettati (frecce singole). Tripla frecce indicano grandi infiltrazioni cellulari nel parenchima epatico ponte tra vicini spazi portali. B: rappresentazione immunoistochimica della fibrosi epatica a 4 settimane dopo l'infezione con Ad-2D6 o Ad-controllo. Le sezioni di fegato sono stati colorati per il collagene con un anticorpo anti-collagene I. Nota strato multiplo di disposizione collagene sotto la capsula fegato (frecce triple) con alcuni fasci sporgenti nel parenchima (frecce singole) e la presenza di grandi cluster di cellule infiltranti (punte di freccia). Due sezioni di fegato rappresentative vengono visualizzati per ogni condizione. Bar Dimensioni: 100μm. Una terza caratteristica è la generazione di alti titoli di anticorpi anti-CYP2D6, che hanno una specificità simile a epitopo umani LKM-1 anticorpi 6,13. Ultimi, hCYP2D6 specifiche CD4 e CD8 T, che sono generati prevalentemente a casa per il fegato. Tali hCYP2D6-specifiche cellule T può essere rilevata dalla stimolazione con immunodomigravide hCYP2D6 peptidi e successiva misura di espressione IFNy da una colorazione intracellulare di citochine (ICCS) (figura 4). hCYP2D6 specifiche cellule CD8 T uccidere Ad-2D6-infettate cellule bersaglio in vivo 12. Figura 4. hCYP2D6 specifiche cellule T mediante citometria a flusso. hCYP2D6 di specifiche cellule T. Linfociti del fegato sono stati isolati a 4 settimane dopo l'Ad-2D6-infezione e sono stati stimolati sia con i CD4 e CD8 immunodominanti hCYP2D6 epitopi durante la notte. Generazione di IFNy è stato rilevato mediante colorazione citochina intracellulare e analizzati mediante citometria a flusso utilizzando uno FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Germania). La percentuale di hCYP2D6-specifici CD4 e CD8 è indicata.