Le modèle du CYP2D6 animale: Comment provoquer une hépatite auto-immune chez la souris

1. L'injection intraveineuse d'Ad-2D6 dans le sinus ophtalmique Dans des conditions stériles, diluer la solution Ad-2D6 stock de virus à une concentration de 5 x 10 9 pfu / ml dans du RPMI et de garder la solution de virus Ad-2D6 sur la glace. L'injection de deux doses de 5 x 10 8 pfu (par voie intraveineuse et intrapéritonéale) s'est avéré entraîner le résultat le plus fiable de l'hépatite auto-immune chez la souris de la souche FVB. Anesthésier la souris avec 4% d'isoflurane dans une chambre d'anesthésie. Pincez la patte arrière pour s'assurer que l'animal est anesthésié. Maintenez la souris par l'arrière du cou et serrer la peau lâche de la tête avec le pouce et le majeur. Comme ça, l'œil dépasse légèrement par la traction de la peau adjacente à l'œil. Placez l'aiguille verticalement dans le canthus interne (jonction des paupières les plus proches de nez de l'animal) et injecter lentement une solution de 100 ul virus Ad-2D6. Il est important de ne pas appliquer trop de pression, àéviter d'endommager les vaisseaux et de la trachée. Lentement retirer l'aiguille pour éviter de renverser et de fermer les paupières. Injection a bien fonctionné, si la solution de virus ne fuit pas le nez creux et l'œil glisse en arrière à sa position initiale. Immédiatement après l'injection intraveineuse, pratiquer une injection intrapéritonéale norme de la seconde 100 ul de la solution de virus Ad-2D6. Sinon, l'injection par voie intraveineuse peut être exécuté via la veine caudale. Cependant, l'injection par le sinus ophtalmique est beaucoup plus facile à réaliser et minimise la perte de la solution de virus. Il a été démontré que ces deux techniques peuvent être utilisées de façon interchangeable et que les deux voies sont tout aussi efficaces 10. Les souris infectées sont surveillés pour les effets indésirables et les signes évidents de souffrance et de douleur, tels que perte d'appétit, perte de poids, perte de mobilité, l'absence de marié, pelage rugueux, voûtél'apparence, ainsi que léchage, les morsures, égratignures, ou en secouant un domaine particulier (c.-à-site de l'injection). Bien que les souris présentent un dommage massif pour le foie dans le modèle du CYP2D6, les souris semblent en bonne santé et ne présentent aucun signe de souffrance, de douleur ou le stress. Néanmoins, les indicateurs d'insuffisance hépatique sévère, telle que aminotransférases sériques sont déterminés sur une base régulière ou qui font partie des expériences réalisées. Les taux sériques de transaminases> 1000 U / l ne doit apparaître que comme une conséquence directe de l'infection virale, mais pas de façon chronique. Si les taux sériques d'aminotransférases sont chroniquement au-dessus de 1000 U / l (limite la gravité), les souris sont sacrifiées. 2. Saignements des yeux de souris Anesthésier la souris avec 4% d'isoflurane dans une chambre d'anesthésie. Pincez la patte arrière pour s'assurer que l'animal est anesthésié. Maintenez la souris par l'arrière du cou et serrer la peau lâche de la tête avec le pouce et le majeur. Comme ça, l'œil dépasse légèrement parla traction de la peau adjacente à l'œil. Placez l'extrémité du tube capillaire dans le coin inférieur ou interne de l'œil et a glissé doucement mais fermement aux côtés du globe oculaire pour le sinus veineux ophtalmique. La rupture capillaires veineux et l'hémorragie résultant remplit la cavité orbitaire. Légèrement retirer le tube capillaire pour libérer l'ni les pourboires de telle sorte que le sang accumulé est important de tenir dans le tube. Lorsque suffisamment de sang sont collectées, le tube est retiré et les paupières closes. Saignement s'arrête au moment du retrait du tube et de rétablissement de la pression oculaire normale sur le complexe veineuse. Sang dans le tube capillaire est transféré dans un tube Microtainer et incubées pendant 30 min sur la glace. Le tube Microtainer est centrifugé à 7500 xg pendant 2 min à 4 ° C. Le surnageant correspond au sérum qui est transférée dans un nouveau tube et stockés à -80 ° C. Le sérum peut être utilisé pour déterminer le titre d'anticorps par ELISA. Indicateurs de lésions du foie telles que les taux sériques des enzymes hépatiques alanine aminotransférase (ALT / GPT) et d'aspartate aminotransférase (AST / GOT) peuvent être évalués en utilisant les bandelettes de test selon de Roche Diagnostics (Mannheim, Allemagne) et un analyseur Reflotron plus ( Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne). Alternativement, le prélèvement de sang peut se faire via la veine caudale ou par l'intermédiaire de la veine temporale superficielle 11. 3. Perfusion du foie de souris Remarque: Cette étape est importante pour éviter une contamination des lymphocytes hépatiques isolées par les lymphocytes du sang Euthanasier la souris par des doses létales de CO 2 suivie par dislocation cervicale. Monter l'animal couché sur le dos sur la planche en mousse de polystyrène. Utilisez 23 aiguilles G à la broche extrémités. Hydrater et désinfecter la souris avec 70% EtOH À propos de 1 cm de distance de pattes de derrière, faire une incision à traversla peau et la couche musculaire. Couper des deux côtés de l'animal de travail allant jusqu'à le diaphragme. Lorsque la membrane est atteint de la peau peut être basculé vers l'arrière. Coupez le diaphragme à l'écart des déchirures puis couper la veine cave. Déplacez l'estomac et les intestins sur le côté, l'exposition de la veine porte. Dans la veine porte insert une aiguille de 27 G relié à une seringue de 5 ml remplie avec du PBS froid. Laissez le PBS lentement laver le sang hors du foie. Disséquer le foie par l'accaparement sur le diaphragme du et de coupe le diaphragme loin du corps. Transfert du foie à une boîte de Pétri et enlever le diaphragme, la vésicule biliaire et tout autre tissu toujours connecté au foie Transfert du foie à 10 ml de PBS dans un tube de 50 ml sur la glace ou incorporer dans composé octobre 4. Isolement des lymphocytes hépatiques Préparer les solutions mères suivantes: Collagénase IV de stock (100 mg / ml) in PBS. (Assurez-petits aliquots et conserver à -20 ° C). DNase (25 mg / ml) dans du PBS. (Assurez-petits aliquots et conserver à -20 ° C). Collagénase mémoire tampon: PBS contenant 0,2 mg / ml de collagénase IV, 0,02 mg / ml DNase et 5% de FCS; pour 1 foie, mélanger 9,5 ml PBS glacé, 20 pl de la collagénase IV (100 mg / ml de bouillon), 8 pi DNase ( 25 mg / ml de bouillon de), et 500 ul FCS inactivé par la chaleur. 35% de Percoll; mélange 175 ml de Percoll, 20 ml 10 x PBS stock; 305 ml de PBS. RPMI complet = RPMI contenant 10% de FCS inactivé par la chaleur, 100 μ / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine. Transfert le foie perfusé (voir section 3) à 10 ml de PBS frais dans une boîte de Pétri sur la glace et les couper en petits morceaux avec des ciseaux. Transfert dans une passoire 70 um cellule et jonques du foie se faufiler à travers avec un pilon de verre ou d'un pilon à partir d'une seringue de 2 ml. Ajouter avec précaution 10 ml de tampon froid et de la collagénaseappuyez sur passoire. Recueillir la suspension et filtrer à travers la crépine deux fois plus. Transfert suspension frais tube de 50 ml sur la glace. Traiter le foie prochaine. Incuber la suspension des cellules du foie à 37 ° C pendant 60 min, mélanger délicatement toutes les 15 min. Centrifuger à 30 xg pendant 3 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube, en laissant 5 mm au-dessus du fluide à granulés Centrifuger à 650 xg pendant 10 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant, en laissant 3 mm au-dessus culot Resuspendre le culot dans 20 ml de tampon de Percoll Centrifuger à 600 xg pendant 20 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension culot en tapotant le tube. Laver pastille 1 x avec du PBS. Laver pastille 1 x avec RPMI complet Resuspendre le culot dans 3 ml de RPMI remplir et compter les cellules dans une dilution de 1:10. Resuspendre les cellules à environ 10 7 cellules / ml dans du RPMI remplir et le tube de transfert à la glace. </ol> 5. Coloration des cytokines intracellulaires (CIEC) 5.1 Stimulation: Préparer les lymphocytes du foie à ~ 10 7 cellules / ml dans RPMI complet tel que décrit. Plaque 100 pi (10 6 cellules) / puits dans une plaque plane de 96 puits qui n'est pas de culture de tissus traités. Ajouter 50 pi RPMI complet contenant 2μg/ml Bréfeldine A, puis ajouter 50 pi RPMI complet contenant 2 pg / ml stimuler CYP2D6 peptide (c'est à dire les CD4 épitope immunodominant CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 ou le immunodominant CD8 épitope CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Mélanger à la pipette. Incuber pendant 5 heures à 37 ° C (temps de stimulation optimal, mais une nuit d'incubation fonctionne aussi bien). 5,2. Coloration: Préparer les solutions mères suivantes: Tampon FACS: PBS contenant 1% de veau foetal sErum (FCS). Fixation / Perméabilisation buffer: tampon FACS contenant 0,1% de saponine et du paraformaldéhyde à 4% Tampon de lavage FACS / saponine: tampon FACS contenant de la saponine à 0,1% FACS / PFA mémoire tampon: tampon FACS contenant 1% de paraformaldéhyde (PFA) Transfert des cellules dans la plaque de microtitration à fond en V (96 puits) et de spin à 460 xg pendant 3 min à 4 ° C. Jeter à moyen et à vortex Ajouter 150 pi de tampon FACS et centrifuger à 460 xg pendant 3 min à 4 ° C. Jeter moyen et plaque de à vortex. Répétez étape de lavage. FcR surface du bloc si nécessaire (lors de l'utilisation des anticorps secondaires) avec 1 ug / ml αCD16/32 cocktail (bloc FcR) dans un tampon FACS pendant 15 min à 4 ° C et laver 2 x avec 150 ul tampon de coloration (460 xg pendant 2 min à 4 ° C). Colorer pour les molécules de surface: Anti-dire CD8a-FITC mAb 10 pg / ml dans 50 ul de tampon FACS pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité. Ajouter 100 ul FACStampon et de spin à 460 xg pendant 3 min à 4 ° C. Laver les cellules 2 x avec 150 ul de tampon FACS (460 xg, 3 min, 4 ° C). Plaque de Vortex. Fixer / perméabiliser les cellules avec 100 pi de fixation / perméabilisation tampon pendant 10 min à température ambiante. Spin à 460 xg pendant 7 min à 4 ° C. Notez qu'il est important d'étendre le temps de centrifugation à 7 min, depuis la fixation / étapes permeabilzation modifie la densité globale des cellules. Plaque de Vortex. Laver 2 x avec 150 pl / FACS tampon de lavage saponine (460 xg, 7 min, 4 ° C). Plaque de Vortex. Colorer molécules intracellulaires: c.-à-Anti-IFN-PE mAb 10 pg / ml dans 50 pl / FACS tampon de lavage saponine pendant 30 min à 4 ° C. Ajouter 100 pl / FACS tampon de lavage saponine et de spin à 460 xg pendant 7 min à 4 ° C. Laver les cellules avec 2 x 150 l / FACS tampon de lavage saponine (460 xg, 7 min, 4 ° C). Plaque de Vortex. Laver les cellules avec 1 x tampon FACS (460 xg, 7 min, 4 ° C). Plaque de Vortex. </li> Resuspendre les cellules dans 200 ul / PFA FACS tampons, transfert dans des tubes, et conserver à 4 ° C dans l'obscurité jusqu'à l'acquisition de données par cytométrie en flux. Nous avons l'habitude d'utiliser un FACSCanto II ou un FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne). 6. Immunohistochimie 6,1. Coloration H & E pour l'évaluation de la pathologie générale du foie: Foie de récolte, plonger dans Tissue-Tek OCT dans un moule de base disponible et de congélation rapide sur la glace sèche. Couper 7 sections um foie tissu en utilisant un cryostat Leica fixé à -17 ° C et monter les coupes de tissus sur Superfrost Plus des lames de microscope. Stocker les lames à -20 ° C jusqu'à l'utilisation. Fixer cryosections en pré-refroidi EtOH pendant 15 min à -20 ° C. Laisser sécher pendant 10 min. Laver 2 x dans l'eau distillée pendant 2 min à température ambiante (les étapes suivantes, 6.1.5 – 6.1.13, sont réalisées à température ambiante). Colorer dans une solution d'hématoxyline de Meyer pour8 min. Laver à chaud (30 ° C) l'eau du robinet pendant 10 min. Changer l'eau plusieurs fois. Rincer à l'eau distillée. Rincer dans de l'EtOH 95% pendant 20 sec. Contre de l'éosine G / Y solution pendant 40 secondes. Déshydrater dans EtOH 2 x 95% pendant 5 min par incubation. Déshydrater dans EtOH 2 x 100% pendant 5 min par incubation. Clarifier dans le xylène 2 x 5 min par compensation. Monter dans Roti-Histokitt. 6,2. L'immunohistochimie pour le collagène I de dépôt: Foie de récolte, plonger dans Tissue-Tek octobre dans un moule de base disponible et de congélation rapide sur la glace sèche. Couper 7 sections um foie tissu en utilisant un cryostat Leica fixé à -17 ° C et monter les coupes de tissus sur Superfrost Plus des lames de microscope. Stocker les lames à -20 ° C jusqu'à l'utilisation. Fixer cryosections dans EtOH froid pendant 15 min à -20 ° C. Laisser sécher pendant 10 min. Laver 2 x dans du PBS pendant 2 min à température ambiante. <li> Incuber dans du PBS contenant 0,3% de H 2 O 2 et 0,1% de Na-azide pendant 10 min à température ambiante. Laver 2 x dans du PBS pendant 2 min à température ambiante. Bloquer avec un kit avidine-biotine de blocage selon les directives du fabricant. Bloc avec 10% de FCS dans du PBS (FCS / PBS) pendant 30 min à température ambiante. L'anticorps primaire est un lapin anti-souris collagène de type I d'anticorps qui est dilué à 1:200 dans 10% FCS / PBS. Incuber les coupes avec l'anticorps primaire pendant 2 heures à température ambiante. Lavez les articles 3 x dans du PBS pendant 4 min à température ambiante. Diluer biotinylé anti-anticorps de lapin à 1:500 et incuber avec les sections pour 1,5 h à température ambiante. Lavez les articles 3 x dans du PBS pendant 4 min à température ambiante. Réaction colorée est obtenue par incubation séquentielle avec de l'avidine-peroxydase et de peroxyde d'hydrogène-diaminobenzidine selon les directives du fabricant. Contre de Meyer Ilsolution matoxylin pendant 5 min, laver 2 x dans du PBS pendant 2 min à température ambiante et monter dans Aquatex. 7. Les résultats représentatifs L'infection de souris avec Ad-2D6 induites deux étapes distinctes de dommages au foie. Dans les premiers jours après l'infection, infection par le virus du foie entraîne une augmentation aiguë des taux sériques de transaminases, un indicateur de la mort des hépatocytes 6. Cette première phase aiguë se produit indépendamment de l'expression de hCYP2D6 et peut également être observée après une infection par un virus de contrôle vide (Ad-Control) ou d'un virus exprimant la protéine de fluorescence verte (GFP-annonce). En revanche, la deuxième étape est auto-immune et dépendante de l'expression de la molécule déclenchant hCYP2D6. Cette étape auto-immune survient dans les 2-4 semaines après l'infection et persiste pendant plusieurs mois 6. <p class = "jove_content"> Figure 1. Le CYP2D6 modèle. Type sauvage ou FVB souris C57BL / 6 sont injectés avec deux doses de Ad-2D6 (par voie intraveineuse et intrapéritonéale). À une époque de l'intérêt du foie et le sérum sont recueillis et évalués pour des dommages au foie et à la formation des anticorps spécifiques hCYP2D6 et les cellules T. Les fonctionnalités suivantes sont caractéristiques de l'hépatite auto-immune persistante en développement après l'annonce-2D6-infection de type sauvage ou FVB souris C57BL / 6 dans le modèle du CYP2D6: d'abord, le foie montre une morphologie aberrante changé. En particulier, les lobes du foie sont fusionnées, des nodules hyperplasiques semblent éparpillés sur l'ensemble du foie et une fibrose capsulaire massive est visible (figure 2). Figure 2. La morphologie du foie. Typique des dommages au foie Ad-2D6-induite, tel que détecté à la semaine 4 post-infection. Notez que les lobes du foie individuels sont fusionnés (flèches). Nodules hyperplasiques semblent éparpillés sur l'ensemble du foie (flèches). L'infection par un adénovirus contrôle n'exprime pas hCYP2D6 n'a aucun effet sur la morphologie du foie. Deuxièmement, étendue et persistante des infiltrations cellulaires apparaissent dans les régions péri-portales et parenchymateuses des foies de souris Ad-2D6-infectés mais pas Ad-Contrôle-infectées (figure 3A). Fibrose se développe principalement dans la région sous-capsulaire avec quelques faisceaux de collagène en saillie dans le parenchyme (figure 3B). Figure 3. Une histologie hépatique:. Coloration H & E de la section de tissu du foie de souris infectées par le FVB soit Ad-Control ou Ad-2D6 à la semaine 4 post-infection. Notez que les infiltrations importantes de cellules mononucléaires sont présentes uniquement dans Ad-2D6 souris infectées (flèches simples). Flèches triples indiquent de plus grandes infiltrations cellulaires dans le parenchyme hépatique pont entre voisins espaces portes. B: représentation immunohistochimique de la fibrose hépatique à la semaine 4 après l'infection par Ad-2D6 ou Ad-contrôle. Les coupes de foie ont été colorés pour le collagène à l'aide d'un anticorps anti-collagène de type I. Notez couches multiples de la disposition de collagène sous la capsule du foie (flèches triples) avec quelques faisceaux pénétrant dans le parenchyme (flèches simples) et la présence de grands groupes de cellules infiltrant (pointes de flèches). Deux sections du foie représentatives sont affichées pour chaque condition. Taille: 100 microns bars. Une troisième caractéristique est la nouvelle génération de titres élevés d'anticorps anti-CYP2D6, qui ont une spécificité de l'épitope semblable à l'homme LKM-1 anticorps 6,13. Enfin, les hCYP2D6 spécifiques CD4 et CD8 sont générés principalement que la maison pour le foie. Ces hCYP2D6 cellules T spécifiques peuvent être détectés par la stimulation avec immunodomienceintes hCYP2D6 peptides et de mesure ultérieure d'expression IFNy par une coloration des cytokines intracellulaires (CIEC) (figure 4). hCYP2D6-lymphocytes T CD8 spécifiques tuer les cellules cibles Ad-2D6-infectés in vivo 12. Figure 4. lymphocytes T spécifiques. hCYP2D6-analyse par cytométrie en flux des cellules T spécifiques. hCYP2D6- Lymphocytes du foie ont été isolés à la semaine 4, après l'annonce-2D6-infection et ont été stimulées avec soit les CD4 ou CD8 immunodominants hCYP2D6 épitope nuit. Génération d'IFNy a été détectée par coloration des cytokines intracellulaires et analysés par cytométrie en flux en utilisant un FACS Canto II (BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne). Le pourcentage de hCYP2D6 spécifiques CD4 et CD8 est indiqué.