Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray'ler

1. Düşük kirlenme plan hazırlanması Bir 50 mL santrifüj tüpüne – poli (hidroksietil metakrilat) (PHEMA) (hücre kültürü, test edilen Sigma), 2 g tartılır. 95 50 ml% (v / v) su, etanol içinde çözülür. Bu genellikle sonication 24 saat sürer. PHEMA çözümü ile Dip-kat epoksi-fonksiyonel cam slayt (GENETIX). Epoksi grupları hızla PHEMA kaplama ile kovalent bağları oluşturmak olacaktır. Dip kaplama cımbız ile cam slayt tutan ve çözelti içine kayar daldırma ile elde edilir. Slaydın Tipik olarak 5 mm slaydı yönlendirmek için kullanışlı olduğunu ve aynı zamanda bir yapıştırma yüzey olarak bir pozitif kontrol olarak hareket edebilir olduğu, kaplanmamış bırakılır. Slayt, daha sonra 1 s boyunca PHEMA çözelti çekilir ve ters bir slayt tutucu yerleştirmeden önce 10 dakika boyunca yakın bir yatay pozisyon içinde kurumaya bırakılmıştır. PHEMA kaplanmış slaytlara ardından t tamamen buharlaşmasını sağlamak için 1 hafta için atmosferik koşullar bırakılırdiye çözücü. 2. Monomer çözeltisinin hazırlanması Foto başlatıcı 2,2-dimetoksi-2-fenil asetofenon, 120 mg ağırlığında ve% 4 (w / v) foto başlatıcı çözelti yapmak için dimetilformamit (DMF) 3 mL ekleyin. Bu iyi, her baskı işletmesi önce taze yapılır, kütle ve yapılan çözelti hacmi photoinitiator çözüm gerekli olur ne kadar uyacak şekilde değiştirilebilir böylece. Çözüm bir aya kadar stabildir. Monomer çözüm temiz monomer 3 parçaları foto başlatıcı solüsyonu, 1 kısım ekleyerek yapılır. Bu, 384 iyi kaynak plaka içine foto başlatıcı çözeltisi ve monomerin 15 ul 5 mcL pipetleme ile elde edilir. 20 ul toplam hacim leke oluşumu için idealdir. Yüksek hacimli üniforma noktalar üretilebilir önce ek blotting gerektirir. Daha küçük miktarlar pin eksik yükleme neden olabilir. Bu yöntem, şu anda vi ile DMF içinde çözünür akrilat / metakrilat monomerlerin kullanımı ile sınırlıdırBu araştırılmış olan tek kombinasyonları olmak RTUE, akrilamidler ve diğer çözücüler baskı işlemi için müsait olması muhtemeldir. Alt monomer konsantrasyonu katı monomerler için kullanılabilir olmasına rağmen, monomer konsantrasyonu, sıvı monomer de ihtiyaç vardır (% 75 w / w) elde etmek için önerilmiştir (düşük monomer konsantrasyonu olduğunu ancak olumsuz sonuç polimerin yüzey kimyası değiştirmek için görünmez ) moleküler ağırlığı ve cam geçiş sıcaklığı değiştirilmiş olması muhtemeldir. Oldukça uçucu monomerler polimerizasyonundan zaman UV aşamasından önce bağlı monomer hızlı buharlaşma için kullanılması zordur. Bir çalışma olarak uzun 6 saat olarak ve çalıştırma uçucu monomerlerden sonuna doğru sunar monomer çözeltilerinden sayısına bağlı olarak, kaynak plaka buharlaşana olacaktır. Uçucu monomerlerin kullanılması baskı aşamasında soğutma ve kısa baskı yalnızca çalışır kullanılarak elde edilebilir. Birkaç yüksek hidrofilik monomerlerin haricindedışı halde örneğin poli (etilen glikol) akrilat, sulu tamponlar içinde çıkan polimer noktaları arasında erime böylece, gözlenmemiştir olarak, bir çapraz bağlı monomer, kullanımı gerekli değildir. 3. Polimer mikroarray oluşumu Polimer mikrodizi oluşumu için tipik bir prosedür Şekil 1 'de şematik olarak gösterilmiştir. Mikroarray oluşumu XYZ aşamada (Şekil 2) kullanarak iletişim robotu (Biodot) kullanılarak elde edilir. 220 mikron çap Oluklu pimleri (Arrayit 96B) kullanılmaktadır. Tüm işaretçilerine baskı çalışması öncesinde ve aynı şekilde çivili da temizlenmesi gerekir 10 dakika için diklorometan sonication tarafından temizlenmelidir. Pins blot ve dizi Slaytlar yüklenip ardından tüm odasının oksijen polimerizasyon radikallerin soğutma önlemek için yeterince düşük olan 2000 ppm, aşağıda oksijen seviyesini azaltmak için argon dolu, tutucu içine yüklenir. Nem maintaine olduğunu% 30-40 arası d. Nem dahil PHEMA tabaka içine işlemek ve fiziksel olarak yüzey 2 ile sürüklenen olmak için oluşturulan polimer için izin şişmeye PHEMA sağlar. Baskı çalışması başlatılır. Her bir işlem şunlardan oluşur: Kaynak plaka örneği yükleniyor. Işaretçilerine 2.5 s için çözüm düzenlenen 25 mm / s hızında çözümleri içine indirdi ve sonra 25 mm / s (Şekil 2) bir hızda çekilir. Pins pin dışından monomer çözeltisi tortularını çıkarmak için yazdırmadan önce lekeli gerekir. Akabinde monomer teslimat tutarlı nokta oluşumunu elde etmek piminin quilled kısmından oluşur. Kullanılan kurutma sırası temiz bir cam slayt ile 33 kişi oluşur. İlk dört pozisyon için yapılan temasların sayısı 10, 5, 4 ve sırasıyla 3'tür. Sonraki dört pozisyonları 2 kişiler yapılır ve son 3 pozisyonlarda 1 kontak yapılır. Her kişi için toplam temas süresi 10 ms ve yaklaşım ve çekilme hızı 175 dirmm / s. Bu noktada oluşan lekeler, tutarlı bir şekil ve geometri olmalıdır. Bu noktada başarısızlık monomer çözümleri kirli işaretçilerine veya toz kirletici gösterir. Monomer çözeltilerinden sonra PHEMA kaplı cam slayt (Şekil 2) üzerine yazdırılır. Bir kişi 175 mm / s bir iğne hareketi nokta başına yapılan ve monomer çözeltisi viskozite ve yüzey enerjisi bağlı olarak 400 mikron arasında ortalama spot çapı verir 10 ms zaman başvurabilirsiniz. Genellikle 3 tekrarlı dizilerin her bir cam slayt üzerine yazdırılır ve 10 slaytlar toplam tek bir çalışma üzerinde yazılıdır. Bu döngü başına 30 noktalar eşittir. Pimler DMF içinde yıkanır. Taze DMF içindeki 2.5 L tüm yıkama çalışma sağlanır. Pimler ajitasyon ile bir akış banyosu içinde yıkanır. Yıkama ile eş zamanlı olarak, yeni basılmış slaytlar 30 s süren yıkama süresi boyunca 30 mV / cm 2 lik bir yoğunlukta bir kısa dalga boyunda UV (365 nm) kaynak ile ışınlanır. After tüm monomer çözeltilerinden dizilerinin ilave 10 dakika boyunca UV (365 nm) ile ışınlanır bastırılır. Taze basılmış diziler unpolymerized monomer ve solvent kaldırmak için 1 hafta süreyle düşük basınç (<50 mTorr) tutulur. 4. Yüksek verim yüzey karakterizasyonu (HTSC) HTSC tekniklerinin genel bir şeması Şekil 3'de gösterilmektedir. Otomatik, yüksek verimlilik yaklaşımı Merkez karakterizasyonu aparatı ile polimer mikroarray uyum olduğunu. Tüm durumlarda bu dizinin bir üstten görünümünü veren bir kamera kullanılarak elde edilir. Başlangıçta, bir dizi sahne XY hareketi ile hizalamak için döndürülür. Dizinin bir köşesinde nokta sonra bulunan ve belirli koordinatları belirlenir. Her polimer nokta pozisyonu sonra dizinin boyutları kullanılarak tahmin edilebilir. Su temas açısı (WCA) ölçümleri WCA ölçümleri üzerindeki sesil damla yöntemi kullanılarak alınırotomatik Krüss DSA 100 alet. ~ 400 pL hacimli bir su damlası her polimer nokta üzerine bir piezo-odaklı baskı kafası kullanılarak dağıtılır. Bir polimer nokta çapı, tipik olarak 300 mikron ve 100 mikron tipik olarak ise, bu nedenle, tek bir ölçüm polimer nokta başına elde edilebilen polimer yerinde su damlasının taban çapı. XY aşamada yazdırma kafası 7 altında her polimer spot otomatik konumlandırma sağlar. Bu dizinin bir üstten görünümünü sunmaktadır numune üzerinde bulunan bir kamera kullanılarak elde edilir. Başlangıçta, kamera konumu kamera görüntüsü merkezine su damlasının dağıtımı hizalamak için ayarlanması gerekir ve daha sonra dizideki baskı kafası için düzenlenebilir. Yüksek hızlı kamera yüzeye çarpmadan ve daha sonra buharlaşan üzerine damlacık yan profili kaydeder. Açılan ilk etkisini yakalar çerçevesi temas açısı ölçmek için kullanılır. Bir daire damla profi takılırle ve temas açısı sonradan belirlenecek. Zaman-of-Flight İkincil İyon Kütle Spektrometresi (TOF-SIMS) Örnek aşamada yüklenir. Bu öncelikle şarj tazminat ile yardımcı olur temiz Al folyo ile sahne astar ve metal vida sekme kullanımı yerine slayt tutarak içerir. Örnek sahne TOF-SIMS transferi odasına yerleştirilir ve 1.6 × 10 -6 mbar kadar aşağı pompalamak için izin verilir. Numune daha sonra tipik olarak 1.0 x 10 -8 mbar vakum basıncına sahiptir ana analiz odasına transfer edilir. TOF-SIMS ölçümleri tek izotoplu Bi 3 + "demetler modunda" 25 kV işletilen primer iyon kaynağı ile çalıştırılabilir bir ION-TOF IV alet kullanılarak yapılır. A darbeli 1 pA primer iyon demeti 10 saniye mikroarray her polimer yerinde bir 100 × 100 mikron alanından toplanan pozitif ve negatif ikincil iyonları ile, analiz alana rastered edilirToplom alma süresi. İyon kitlelerin doğru kütle ataması sağlayan yüksek çözünürlüklü bir Zaman-of-Flight analizörü kullanılarak belirlenmiştir. Tipik kütlesi çözünürlük (m / z 41 az) sadece 6000 üzerinde oldu. Düşük enerjili elektronlar (20 eV) yalıtkan yüzeylerde 8 pozitif yüklü primer iyon ışını nedeniyle yüzey şarj telafi etmek için kullanılmıştır. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) Otomatik bir sahne ile büyük bir aşama AFM cam slayt üzerine diziler analiz için gereklidir. Bir Boyut veya ICON mikroskop bu amaç için idealdir. Örnek sahnede yerleştirilir ve sahne konumu dizinin sağ üst köşesine homed edilir. Dizinin alt sol köşesinde pozisyon bulunmaktadır, burada bütün diğer lekelerin konumu interpolasyon izin verir. Bir pozisyon listesi oluşturulur ve indirilecek olan yazılım oto-örnekleme özelliği, içine beslenir. AFM ölçümleri mod dokunarak bir NanoScope 3000A cihazı kullanılarak alınıre. Yaklaşık 300 kHz rezonans frekansı ve 40 N / m sabit bir güçle Silikon ipuçları (Tap300Al, Bütçe Sensörler) kullanılır. Polimerin 5×5 mikron bölgeler 9 ölçülür. Karekök (RMS) pürüzlülüğü SPIP toplu işlem yazılımı ile her bir görüntü için bu bölgede ölçülür demek. Her görüntü başlangıçta pürüzlülük ölçümleri öncesinde düzleştirilir. Tüm resimler kılavuzu görüntüleme pürüzlülük ölçümleri kaldırılması gerekebilir görüntüleme eserleri tespit etmek gerekir. Bu adım sırasında görüntüleri de ortak yüzey özellikleri 9 dayalı kategorize edilebilir. X-ışınları fotoelektron spektroskopisi (XPS) Bir mikroarray slayt çift taraflı bant kullanarak bir numune çubuğu yapıştırılmış ve sonradan Kratos Eksen Ultra XPS enstrüman örnek odası yüklenir. Örnek odasına girin ve 10 -8 Torr altında bir basınç ulaşana kadar bekleyin. Uygun işlemBöyle bir monochromated x-ray kaynağı (Al, 1486,6 eV) gibi parametreler, anot (10kV ve 15mA) potansiyel ve mevcut, aralık boyutu (110μm), geçiş enerjisi (yüksek çözünürlüklü tarama için geniş tarama ve 20 eV için 80 eV) olan seçilmiş. X-ışını kaynağı mikroarray iki zıt köşelerinde kullanarak ve örnek oksijen sinyal optimize odaklanmıştır. Bireysel noktalar x ve y pozisyonlarını daha sonra belirlenecek ve bir pozisyon listesi olarak kaydedilir. Bir program grafiği geniş taramalar ve belirli öğeler için yüksek çözünürlüklü taramalar gibi çeşitli veri edinimi için yazılmış ve daha sonra çalıştırılır. Raman spektroskopisi Raman spektrumları Raman mikroskobu LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon) kullanarak her polimer nokta için alınır. Başlangıçta, Raman sinyal silikon ve 520,7 cm -1 Si Raman kayması kullanılarak kalibre edilir. Numune daha sonra sahne üzerine yerleştirilir ve lazer (dalga boyu = 523 nm) odağım, CH Raman kayma maksimize etmek için ayarlanır2950 cm -1. Mikroarray üzerinde sol üst nokta merkezi konumu sonra mikroarray kökeni ve bir harita olarak ayarlanır labRAM İK yazılımı dizi fonksiyon kullanarak kurulumudur. 10 spektrumları 0.5 sn'lik bir ışınlama süresi ile her bir örnek için kümülatif olarak elde edilir. 5. Bakteriyel tahlil Dizi kök hücreler, diğer hücrelerin türleri ve bakteri 3,10,4 eki ve çoğalması gibi birçok farklı biyolojik deneyleri maruz kalabilir. Burada, Şekil 4'te şematik olarak gösterilen bir bakteri bağlanma tahlil, açıklar. GFP ile şekli değiştirilmiş bir bakteri suşunun plazmid 37 gece boyunca kültürlenir ifade ° 200 rpm'de sallama ile 50 ml Falcon tüp içinde LB ortamı 10 ml C 'dir. Bakteri kültürü OD 600 ölçülür ve yeterli bir gece boyunca kültür neden olduğu 15 ml RPMI-1640 tanımlanmış ortam içine inoküle edilir0.01 nihai OD 600. Diziler diziler (unpolymerised monomer, oligomer ve solvent) herhangi erir bileşenleri kaldırmak için 10 dakika sterilize distile suda yıkanmış olan Yıkanmış dizisi slaytlar 10 dakika için sterilize edilmiş, temiz bir petri tabağına ve UV yerleştirilir. Dizisi ile kayar bir petri kabı ile aşılanmış RMPI-1640 ortamı 15 ml yerleştirilir ilave edilir. Aynı zamanda başka bir slayt bir petri tabağına yerleştirilir ve kontrol dışı innoculatd RPMI-1640 ile inkübe edilir. Slaytlar 60 rpm'de sallama ile 72 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilirler. Slaytlar steril PBS içinde 15 mL ile iki kez yıkanır. Slaytlar steril damıtık su içinde 15 mL ile iki kez yıkanır. Slaytlar havada kurutulmuş vardır. Slaytlar bir 488 nm uyarma lazer ve standart mavi emisyon filtresi (510-560nm) ile GenePix Autoloader 4200AL Tarayıcı (Moleküler Cihazlar, ABD) kullanılarak görüntülü. Temsili bir polimer otofloresans görüntüŞekil 2 de gösterilmiştir. Bu GFP çürümesini önlemek için en kısa sürede yapılmalıdır. Bu mümkün değilse hücreleri fiksasyon uygulanmalıdır. Ayrıca, bilinen bir bakteriyel yanıt uygun pozitif kontrol dahil sonuçları normalleştirmek ve nicelik karşılaştırılabilir olması için farklı günlerde yapılan deneyler izin edebilmek için şarttır. Polimer noktalar toplam floresans yoğunluğu GenePix Pro 6 yazılımı (Moleküler Cihazlar, ABD) kullanılarak elde edilir. Bu bakteri ve sadece medya ile inkübe hem slaytlar için yapılır. Bakterilerin büyüme nedeniyle floresans bulmak için ortam denetimi floresans bakteri ile inkübe slayt üzerinde ölçülen floresans çıkarılır. Slaytlar de 30 dakika ve oda sıcaklığında 20 uM SYTO17 nükleik asit boya (Invitrogen, UK) ile boyanmış ve ZEN 2009 görüntüleme yazılımının (Carl Zeiss, Almanya) ile birlikte bir Carl Zeiss LSM 700 lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Bakterilerin kapsamayüzey üzerinde açık kaynak Image J 1.44 yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüsü, ABD) kullanılarak belirlenir. 6. Temsilcisi Sonuçlar Baskı koşullarında yüksek kaliteli polimer mikroarrayler yazdırmak için optimize edilmiştir. Nemi% 30-40 arasında tutulmalıdır. Bu nem PHEMA tabaka kabarma ve alt tabaka ile polimerin fiziksel olarak yakalanmalarında izin vermek için yetersiz olduğunu öne, sulu ortamlar içinde polimer noktaları% 30 altında bir nem basılmış dizileri için sık sık gözlenmiştir delaminasyon. Nem polimer noktaları çap değiştirmek için daha fazla artmıştır, ancak bu monomer kimya bağlıdır edilebilir. Örneğin, burada polimerizasyon çözeltisinin eşit hacimleri bir ay için bir hidrofilik etilen glikol parçası eşit hacimde iken içeren bir monomer için basılı ve nem artışına paralel olarak 40-80 'den% nokta çapı 430 um den 370 um' ye düşürülmüştürhidrofobik bir alifatik karbon halka yapısı içeren Nomer spot çapı 290 mikron ila 350 mikron (Şekil 5) yükselmiştir. Polimerizasyon derecesi 1720 cm -1 C = O Raman kayması ile normalize edilmelidir 1640 cm -1 algılandığında C = C Raman kayması, ölçmek için Raman spektroskopisi kullanılarak izlenebilir. Raman spektrumları çeşitli UV ışınlarına maruz kalma (Şekil 6) polimerize polimer noktalar için ölçüldü. C = C: C = UV ışınlarına maruz kalma 0 ile 50 s için arttıkça O oranı daha da azalması hiçbir bunun üzerine, azaldı C = C: C = O oranı daha fazla UV ışınlaması (Şekil 6) ile gözlenmiştir. Raman spektrumları çeşitli O 2 düzeyi ve C = O 2 seviyesi 2000 ppm azalmış gibi C Raman kayması ancak hiçbir daha fazla azalma (aşağıda bir O 2 düzeyi için gözlendi gözlendi Şekil 7A de polimerize polimer lekeler için ölçüldü ). Raman Spektroskopisi da vakum s yeteneğini göstermiştirunpolymerized monomer kaldırmak tep. Önceki vakum ile C = C Raman kayma 2000 ppm (Şekil 7A) ile karşılaştırıldığında, 3300 ppm polimerize edilmiş polimeri için daha büyük olan, ancak, vakum sonra Raman kayma yüksekliği bütün unpolymerized monomer düşündürmektedir (Şekil 7B) ayırt edilemez vakum adımı sırasında kaldırıldı. Özetlemek gerekirse, polimerizasyon şartları% 30-40 nem, 7 gün boyunca baskıdan sonra bir vakum ekstraksiyon adım ile 2000 ppm altında bir O 2 düzeyinde 50 s'den daha yüksek UV ışınlarına maruz kalma sayılabilir. Baskı ve vakum ekstraksiyon sonra polimer noktalar polimerizasyon başarısını belirlemek için basit ışık mikroskobu ve anormal nokta morfolojileri değerlendirilebilir. Tipik olarak, noktalar olarak sol tarafta, Şekil 8'de gösterildiği gibi, dairesel ve aynı görünür. Geometri bir değişiklik için olası nedeni, bozuk veya kirli pin. Monomer kombinasyonları küçük bir sayı için biz e, şekilsiz lekeler gözlemledikBüyük üstünde merkezi bir nokta olduğu yerde sağdaki Şekil 8'de gösterildiği küçük noktalar, ya da kızarmış yumurta şeklinde bir uydu ile merkezi bir nokta xample, nokta düz. Bu önceden monomerlerin viskozite, hidrofil, volatilite veya yüzey gerilimi ve farklılıklar monomer bileşimi bu biçimi ile uyumlu olmadığını göstermektedir ilişkin baskı faz ayrılmasına neden olabilir. Böyle TOF-SIMS gibi teknikleri ile polimer noktalar Ek kimyasal haritalama da noktalar ve dizi boyunca malzemelerin kimyaları dağılımını belirlemek için önemli ve bazen gerekli kalite kontrol adımdır. Bu teknik, aşırı ışık mikroskobu ile görülebilir değil, bazı malzemelerin yayılmasını tespit ve bireysel polimer noktalar içinde faz ayrışması tespit edebilirsiniz. Şekil 1. Şematik bir po oluşumunda dahil olan çeşitli adımlar tasvirlymer nokta. Şekil 2. Başlangıçta bir kaynak plaka monomer ile pin yükleme ve ardından kontak yaparak yüzeye monomer tevdi içeren pin baskı yöntemi şematik. Bir iğne XYZ robot kolu tarafından kontrol edilir. Inset üretim sonrası bir diziden otofloresans tipik bir görüntü gösterir. Şekil 3,. HTSC ve ayrıca polimer microarrays çalışma uygulanan biyodeneyler ile ilişkili teknikleri vurgulanarak şematik. Şekil 4,. Bakteri bağlanma tahlil şematik. Şekil 5. P4-tert-butilsikloheksil akrilat ve di (etilen glikol) etil eter metakrilat: olymer nokta çapı, iki farklı monomer için farklı nem basılmış. Şekil 6. Için Raman yoğunluk oranı C = 1640 cm-1 ve çeşitli UV ışınlarına maruz kalma, 4-tert-butilsikloheksil akrilat polimer noktalar -1 1720 cm-C = O Raman kayma C Raman kayması. Hata çubukları eşit bir standart sapma (n = 3). Şekil 7. Çeşitli seviyelerde O2 basılmış 4-tert-butilsikloheksil akrilat, polimer noktaları için ölçülen Raman spektrumu, her bir spektrum sol gösterilen (A), daha önce ve (B) vakum sonra. C = 1720 cm 1640 cm -1 ve C = O Raman kayması C Raman vardiya -1 Raman yoğunluğu oranı </sup> Her yelpazenin sağında gösterilir. Şekil 8. Iki polimer noktalar bir ışık mikroskobu görüntüsü. Sol taraftaki nokta iyi oluşmuş nokta gösterir, sağ taraftaki nokta iken monomerin bir çok dengesiz dağılımını ihtiva eden bir nokta arasında bir örnektir. Ölçek çubuğu 500 mikron.