バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

1。低ファウリングの背景の準備 50 mLの遠心分離管に – ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（PHEMA）（細胞培養がテストSigma）の2グラムを秤量。水に95％（v / v）エタノール50mLに溶かす。これは通常、超音波処理の24時間かかります。 PHEMA溶液によるディップコートエポキシ官能スライドガラス（GENETIX）。エポキシ基は急速にPHEMAコーティングで共有結合を形成することになる。ディップコーティングはピンセットでスライドガラスを保持し、溶液中にスライドを浸漬することによって達成される。通常はスライドの5ミリメートルは、スライドを配向するために有用であり、また、接着面としてポジティブコントロールとしての役割を果たすか、コーティングされていないままです。スライドは、スライドホルダーに配置する前に反転されて、10分間近く、水平位置で乾燥させ、1秒の期間にわたってPHEMA溶液から引き出される。 PHEMAコーティングされたスライドは、その後、トンが完全に蒸発を可能にするために1週間の大気の状態で残っています彼溶剤。 2。モノマー溶液の調製光開始剤2,2 – ジメトキシ-2 – フェニルアセトフェノンの120 mgを秤量し、4％（w / v）の光開始剤の溶液を作るためにジメチルホルムアミド（DMF）3mLに追加します。これは、最高の各印刷実行前に新鮮に行われ、行われ、ソリューションのように質量と体積は、光開始剤の溶液が必要とされるどのくらいに合わせて変化させることができる。解決策は、月まで安定である。 モノマー溶液は、きちんとした単量体の3つの部分に光開始剤水溶液の1部を追加することによって作られています。これは、384ウェルソースプレートに光開始剤の溶液とモノマーの15μLの5μLをピペッティングすることによって達成される。 20μLの全容積はスポット形成に最適です。量の増加は、均一なスポットが製造することができる前に、追加のブロッティングが必要です。小さいボリュームにはピンの不完全な負荷が発生することがあります。 このメソッドは現在のviで、DMFに可溶であるアクリレート/メタクリレートモノマーの使用に制限されていますこれらのrtueが探求されてきただけの組み合わせである;アクリルアミド及びその他の溶剤は、印刷プロセスの影響を受けやすい可能性が高いです。低いモノマー濃度は固体モノマー（還元モノマー濃度が悪影響を得られたポリマーの表面の化学的性質を変化させるように見えません、しかし、それはであるために使用できますが、モノマー濃度を達成するために、液体モノマーはまた必要とされる（75％w / w）の示唆）分子量、ガラス転移温度が変更される可能性が高い。揮発性の高いモノマーは、重合時にUV硬化工程の前に起因する単量体の急速な蒸発に利用することは難しい。家族がいる限り6時間として、実行揮発性モノマーの終わりに向かって取ることができるモノマー溶液の数に応じて、ソースプレートから蒸発しているだろう。揮発性モノマーの使用は、印刷ステージを冷却し、短いプリントを使用することによって達成することができるのみ実行されます。 いくつかの非常に親水性モノマーの例外を除いてポリ（エチレングリコール）アクリレートなどの水性緩衝液中で得られたポリマースポットの解散は、このように、観測されていないが、除外されていませんが、架橋性モノマーの使用は必須ではありません。 3。ポリマーマイクロアレイ形成ポリマーマイクロアレイ形成のための典型的な手順を図1に概略的に示されている。 マイクロアレイの形成はXYZステージ（図2）を用いた接触ロボット（バイオドット）を使用して達成される。 220μmの直径の溝付きピン（Arrayit 96B）を使用しています。すべてのピンは、プリントランの前に10分間、ジクロロメタンで超音波処理によって清浄化されるべきであり、同様にピンホルダーも洗浄する必要があります。 ピンはブロッティングおよびアレイスライドがロードされ、その後、全体チャンバーは、酸素による重合ラジカルの急冷を避けるために、十分に低い2000ppmで、下に酸素レベルを低減するためにアルゴンで満たされ、ホルダー内に読み込まれます。湿度がmaintaineです百分の30から40までの間でのd。湿度を含めるとPHEMA層を浸透すると物理的に表面2に捕捉さになるために形成されたポリマーを可能に膨潤さPHEMAが可能になります。 印刷実行が開始される。各実行は以下から成ります。 ソースプレートからサンプルをロードしています。ピンは、25 mm / sの速度でソリューションに降ろさ2.5秒のためのソリューションで開催した後、25 mm / sで（図2）の速度で引き抜かれる。 ピンは、ピンの外側からモノマー溶液を除去するために印刷する前にブロットしなければなりません。その後モノマー配信は一貫スポット形成を達成するためにピンの細い色糸を使った縁取り飾りのついた部分から発生します。使用ブロッティングシーケンスは、清浄なガラススライドと33接点で構成されています。最初の4つの位置のために作られたコンタクトの数は10、5、それぞれ4と3です。次の4つのポジション2接点が作られており、最後の3つの位置に1接点が作られています。各連絡先の総接触時間は10ミリ秒であり、アプローチや撤退速度は175mm /秒。この点により形成されるスポットは、一貫した形状とジオメトリを持っている必要があります。この時点での失敗は、モノマー溶液中の汚れたピンや粉塵汚染を示しています。 モノマー溶液は、その後PHEMAコーティングされたガラススライド（図2）上に印刷されています。一つの接点を175 mm / sのピンの動きにスポットごとに作成し、モノマー溶液の粘度と表面エネルギーに応じて10ミリ秒の時間にご連絡さ400μmの平均スポット径が得られます。通常は3回の反復配列は、各スライドガラス上に印刷されており、10枚のスライドの合計が単一の実行に印刷されています。これは、サイクルごとに30箇所に相当します。 ピンをDMFで洗浄する。新鮮DMFの2.5 Lは全体の洗浄を実行するために設けられている。ピンは、攪拌しながら流れ浴で洗浄する。 洗浄と並行して、印刷されたばかりのスライドは30秒持続する洗浄期間中は30 mVの/ cm 2の密度で短波紫外線（365nm）を光源に照射される。 AFTERすべてのモノマー溶液は配列はさらに10分間紫外線（365nm）を照射されて印刷されます。 印刷されたばかりのアレイは、未重合モノマーと溶媒を除去するために1週間の低圧（<50ミリトル）に保たれています。 4。高スループットの表面特性（HTSC） 高温超電導技術の一般的なスキームを図3に示します。自動化された、ハイスループットアプローチの中心となるのは、特性評価装置によるポリマーマイクロアレイのアラインメントである。すべてのケースでは、これは、アレイの上面図を与えるカメラを使用して達成される。最初に、配列はステージのXY移動に一直線に合うように回転される。配列のコーナースポットはその後、特定の座標に位置しており、指定されている。各ポリマースポットの位置は、配列の大きさを用いて予測することができる。 水接触角（WCA）の測定 WCAの測定は、上の液滴法を用いて取得されます自動化されたクルスDSA 100楽器。 〜400ピコリットルの容積を持つ単一の水滴は、各ポリマースポット上にピエゾ駆動型のプリントヘッドを使用して分配される。ポリマースポットの直径は、典型的には300μmで、通常は100μmである、したがって、1つの測定がポリマースポットごとに得られるポリマーのスポット上の水滴のベース直径である。 XYステージは、記録ヘッド7の下にある各ポリマースポットの自動位置決めを可能にします。これは、配列の上面図を提供するサンプルの上方に位置するカメラを使用して達成される。当初は、カメラの位置は、カメラビューの中心に水滴の分配を揃えるように調整する必要があり、その配列は、プリントヘッドに揃えることができます。 高速度カメラは、表面を叩いて、その後、蒸発により液滴の側のプロファイルを記録します。ドロップの最初の衝撃をキャプチャしたフレームは接触角を測定するために使用されます。円はドロップPROFIに嵌合されているルとの接触角は、その後決定した。 飛行時間型二次イオン質量分析法（TOF-SIMS） サンプルは、ステージ上にロードされます。これはまず、電荷補償に役立ちクリーンAl箔、一緒にステージを裏打ちしてから、金属ネジのタブを使用することによって所定の位置にスライドを保持することを含む。 試料ステージは、TOF-SIMSの搬送室に入れ、1.6×10 -6ミリバールまでポンプダウンさせる。サンプルは次に、典型的に1.0×10 -8 mbarの真空圧を有する主分析室に転送される。 TOF-SIMS測定は、モノアイソトピックのBi 3 +の "バンチモード"で25 kVので作動一次イオン源を用いて操作ION-TOF IVの機器を用いて行われている。パルス1pAの一次イオンビームは、10秒間マイクロアレイの各ポリマースポットの100×100μmの領域から集めた正と負の両方の二次イオンを用いて、解析領域の上にラスタ化されているOND取得時間。イオンの質量は、正確な質量の割り当てを可能にする高分解能飛行時間型分析器を用いて測定した。典型的な質量分解能（m / zの41時）ちょうど6000を超えていました。低エネルギー電子（20 eV）の絶縁表面8上に、正に帯電一次イオンビームによる表面の充電を補うために使用されていました。 原子間力顕微鏡（AFM） 自動ステージと大型ステージAFMは、スライドガラス上に配列を解析するために必要です。ディメンションまたはアイコン顕微鏡は、この目的のために理想的です。 サンプルは配列の右上隅にホーミングされているステージとステージの位置に配置されます。 配列の左下隅の位置が検出され、これは、すべての他のスポットの位置を補間することができます。 位置リストが生成され、ソフトウェアの自動サンプリング機能に送り込まれる。 AFM測定はmodをタッピングナノスコープ3000A測定器を使用して得たものです電子。約300 kHzの共振周波数と40N / mの一定の力を持つシリコンチップは（Tap300Al、予算センサー）を使用しています。ポリマーの5×5μmの領域が9で測定されます。 根は平方根（RMS）粗さはSPIPバッチ処理ソフトウェアを使用して、画像ごとに、この地域全体で測定されることを意味します。各画像は、最初は粗さの測定の前に平坦化される。 すべての画像は、粗さの測定から除去する必要があるかもしれません画像アーチファクトを識別するために表示してマニュアルを必要とします。このステップの間に画像も共通の表面の特徴9に基づいて分類することができる。 X線光電子分光法（XPS） マイクロアレイスライドは、両面テープを使用してサンプル·バーに貼り付け、その後クラトス軸ウルトラXPSの測定器の試料室にロードされます。 試料室に入ると、それは10 -8トル未満の圧力に達するまで待つ。 適切な操作（10kVのと15ミリアンペア）潜在的なアノードと現在のような単色X線源などのパラメータ（アル、1486.​​6 eV）で、開口部の大きさ（110μm）、パスエネルギーは（ワイドスキャンの80 eVと高解像度スキャンでは20 eV）のアール選択されています。 X線源は、マイクロアレイの二つの反対の角を使用し、試料から酸素信号を最適化することを当てています。個々のスポットのXとYの位置が決定し、位置リストとして記録されます。 プログラムチャートが書き込まれてから広いスキャンして特定の要素の高解像度スキャンを含む、データの取得のために実行されます。 ラマン分光法ラマンスペクトルはラマン顕微鏡LabRAM HR（ホリバ·ジョバンイボン）を使用して、各ポリマースポットのために取られています。当初、ラマン信号は、シリコンウェハと520.7センチメートル-1におけるSiのラマンシフトを使用して校正されています。 次いで、試料をステージ上に配置され、レーザ（波長= 523 nm）の焦点は、CHラマンシフトを最大にするように調整されている2950センチメートル-1で。 マイクロアレイ上の左上のスポットの中心の位置が原点とlabRAM人事ソフトウェアに配列関数を使用してセットアップされているマイクロアレイのマップとして設定されています。 10スペクトルは、0.5秒の照射時間で各サンプルに対して累積的に取得される。 5。細菌の検定アレイは、添付ファイルと幹細胞、その他の細胞の種類と細菌3,10,4の増殖を含む多くの異なる生物学的ア ​​ッセイに公開することができます。ここでは、図4に概略的に示されている細菌の付着アッセイを、説明します。 GFPで形質転換された細菌株はプラスミド発現し、37℃で一晩培養し、200℃rpmで振盪しながら50mlのファルコンチューブにLB培地を10mLのC。 細菌培養液のOD 600が測定され、十分な一晩培養物をもたらすことを15mLのRPMI-1640に規定された培地に接種し、0.01の最終OD 600インチ 配列は配列（unpolymerisedモノマー、オリゴマーと溶媒）から任意の溶解成分を除去するために10分間滅菌蒸留水で洗う必要のないアール洗浄アレイスライドを10分間滅菌した清浄なシャーレやUVに配置されます。 配列を使用してスライドをペトリ皿に入れ、接種RMPI-1640培地15mLを追加されます。同時に別のスライドをペトリ皿に入れて、コントロールとして非innoculatd、RPMI-1640とインキュベートされる。 スライドは60 rpmで振とうしながら72時間37℃でインキュベートする。 スライドは滅菌PBS 15 mLで2回洗浄する。 スライドは滅菌蒸留水15mLで2回洗浄する。 スライドは、空気乾燥されています。 スライドは488nm励起レーザと標準青色発光フィルタ（510-560nm）でGenePixオートローダ4200ALスキャナ（Molecular Devices社、米国）を用いて結像​​される。代表的なポリマー自家蛍光画像である図2に示す。これは、GFPの崩壊を避けるために、できるだけ早く行う必要があります。これが不可能な場合は細胞が固定を受けるべきである。さらに、既知の細菌応答で適切なポジティブコントロールを含めることは、結果を正規化し、定量的に同等であることが、別の日に行われた実験を可能にするためにできることが不可欠です。ポリマースポットからの総蛍光強度をGenePix Pro 6のソフトウェア（Molecular Devices社、米国）を用いて取得されています。これは細菌と単にメディアと一緒にインキュベート両方のスライドのために行われます。細菌の増殖に起因する蛍光を見つけるにはメディアコントロールの蛍光は細菌と一緒にインキュベートし、スライドに測定された蛍​​光から減算されます。 スライドはまた、室温で30分間、20μMSYTO17核酸色素（インビトロジェン社、英国）によって染色し、ZENの2009イメージングソフトウェア（カールツァイス、ドイツ）を用いてカールツァイスLSM 700レーザー走査顕微鏡を用いて画像化することができる。細菌のカバレッジ表面には、オープンソースの画像J 1.44ソフトウェア（国立衛生研究所、米国）を用いて決定される。 6。代表的な結果印刷の条件は、最高品質のポリマーマイクロアレイを印刷するために最適化されています。湿度は30から40パーセントの間で保たれるべきです。水性環境における高分子スポットの剥離この湿度はPHEMA層が膨潤し、基板へのポリマーの物理的捕捉を可能にするためには不十分であることを示唆し、30％以下の湿度で印刷配列のために頻繁に観察された。湿度は高分子スポットの直径を変更するためにさらに増加し​​たが、これは単量体の化学に依存していることができます。例えば、重合溶液の等量がプリントされ、湿度は40〜80％増加していたとしてスポット径はMOの親水性のエチレングリコール部分等量の一方を含有するモノマーは430μmから370μmに減少していたところ疎水性の脂肪族炭素環構造を含むnomerスポット径は290μmから350μmである（図5）に増加した。 重合度は1720センチメートル-1にC = Oのラマンシフトに正規化する必要があります1640センチメートル-1で検出されたC = Cのラマンシフトを測定するラマン分光法を使用して監視できます。ラマンスペクトルは、様々なUV照射（図6）を重合させたポリマースポットを測定した。 C = C、C = O比は、UV曝露は減少0から50秒まで増加し、それ以上の減少とすぐに、C = C、C = O比は、さらにUV照射（図6）を用いて観察した。ラマンスペクトルはまた、様々なO 2のレベルで重合ポリマースポットを測定したとO 2レベルは2000ppm以下に減少していたとして、C = Cラマンシフトは、しかし、それ以上の削減がこの（図7A以下のO 2レベルで観察されなかったが、観察された）。ラマン分光法は、真空抽出sの能力を実証未重合モノマーを除去するTEP。抽出前に掃除機をかけるために、C = Cのラマンシフトが2000 ppm以下（図7A）と比較して3300 ppmの濃度で重合したポリマーの方が高かったが、真空抽出した後にラマンシフトの高さは、すべての未重合モノマーを示唆した（図7B）と区別がつきません真空抽出工程中に除去されました。要約すると、重合条件は、30〜40％の湿度、7日間の印刷後、真空抽出工程で2000 ppm以下、O 2レベルで50秒以上のUV曝露が含まれています。 印刷·真空抽出後ポリマースポットの重合の成功は、識別するためのシンプルな光学顕微鏡観察して、異常なスポットの形態によって評価することができる。一般的に、スポットは左の図8に示すように、円形で均一に表示されます。ジオメトリーの変化の可能性の高い原因は、破損または汚れたピンです。我々は不格好なスポットを観察しているモノマーの組み合わせの数が少ない場合は、eの大型の上に中央のスポットがあるところ、右の図8に示すように小斑点の衛星、または揚げた卵形で、中央スポットをXAMPLE、スポットは平坦になります。これは、単量体の粘度性、親水性、揮発性や表面張力の違いやモノマーの組み合わせがこの形式と互換性がないことを示唆しているに関連する印刷の前に相分離によって引き起こされることがあります。そのようなTOF-SIMSなどの技術による高分子スポットの追加の化学マッピングもスポットとアレイ全体の材料 "化学物質の分布を決定するために重要な、時には必要な品質管理工程である。この手法は、過剰な光顕微鏡による見えないいくつかの材料の拡散を識別し、個々のポリマーのスポット内で相分離を識別することができます。 図1の回路図は、POの形成に関与する様々なステップを示すlymerスポット。 図2：最初にソースプレート内のモノマーとピンをロードしてから接触させることにより、基板上に単量体を堆積伴うピンの印刷の方法論の概略図。ピンは、XYZロボットアームによって制御されます。挿入図は、生産後の配列から自家蛍光の典型的なイメージを示しています。 図3 HTSCと、ポリマーマイクロアレイの研究に適用されるバイオアッセイに関連する技術を強調回路図。 図4の細菌付着性試験の模式図。 図5。P4-tert-ブチルシクロヘキシルアクリレート、ジ（エチレングリコール）エチルエーテルメタクリレート：olymerスポット径は、2つの異なるモノマーに対して様々な湿度に印刷されます。 図6 1640センチメートル-1多様なUV露光による4-tert-ブチルシクロヘキシルアクリレートのポリマースポットから-1 1720センチメートルでC = Oのラマンシフトで、C = Cラマンシフトに対するラマン強度の比。エラーバー等しい1標準偏差（n = 3）であった。 図7様々なO 2のレベルで印刷された4-tert-ブチルシクロヘキシルアクリレートのポリマースポットを測定したラマンスペクトルは、前と（B）は真空抽出した後、各スペクトルの左側（A）に示されている。 1640センチメートル-1と1720 cm -1のC = OのラマンシフトのC = Cのラマンシフトに対するラマン強度の比</suP>は、各スペクトルの右側に表示されます。 図8 2ポリマースポットの光顕微鏡画像。左の上のスポットはよく形成されるスポットを示し、右側にスポットをしながらするモノマーの非常に不均等分布を含むスポットの一例です。スケールバーは500μmである。