Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

1. Voorbereiding van lage-fouling achtergrond Weeg 2 g van poly (hydroxyethylmethacrylaat) (PHEMA) (Sigma – celkweek getest) in een 50 ml centrifugebuis. Lossen in 50 ml 95% (v / v) ethanol in water. Dit duurt gewoonlijk 24 uur van ultrasoonapparaat. Dip-coat epoxy-functionele glasplaatje (Genetix) met de pHEMA oplossing. De epoxygroepen zal snel vormen covalente bindingen met de pHEMA coating. Dip-coating wordt bereikt door het objectglaasje met een pincet en de dia dompelen in de oplossing. Typisch 5 mm van de schuif blijft onbekleed, die bruikbaar is voor richten van de slede en kan ook fungeren als positieve controle als hechtende ondergrond. De slede wordt vervolgens uit de pHEMA oplossing over een periode van 1 s, omgekeerd en gedroogd in een nagenoeg horizontale positie 10 min alvorens in een houder. De pHEMA gecoate glaasjes worden vervolgens linksaf bij atmosferische omstandigheden voor 1 week om de volledige verdamping van t makenhij oplosmiddel. 2. Bereiding van monomeeroplossing Weeg 120 mg van de fotoinitiator 2,2-dimethoxy-2-fenylacetofenon en aan 3 ml dimethylformamide (DMF) een 4% (w / v) fotoinitiator oplossing. Dit wordt best vers gedaan elke oplage, zodat de massa en het volume van de oplossing die kan worden gevarieerd om te passen hoeveelheid initiator oplossing nodig. De oplossing is stabiel tot een maand. Monomeeroplossingen worden gemaakt door toevoeging van 1 deel van de fotoinitiator oplossing en 3 delen de nette monomeer. Dit wordt bereikt door pipetteren 5 ui fotoinitiator oplossing en 15 pi van monomeer in een 384 putjes plaat bron. Een totaal volume van 20 ul ideaal voor vlekvorming. Hogere volumes extra blotting voor uniforme plekken kunnen worden geproduceerd. Kleinere volumes kunnen onvolledige belasting van de pen. Deze methode is momenteel beperkt tot het gebruik van acrylaat / methacrylaat monomeren die oplosbaar zijn in DMF door virtue deze de enige combinaties die zijn onderzocht, acrylamiden en andere oplosmiddelen waarschijnlijk ontvankelijk voor het drukproces. Ter verwezenlijking van de monomeerconcentratie voorgesteld (75% w / w) vloeibare monomeren zijn ook vereist, hoewel lagere monomeerconcentraties kan worden gebruikt voor vaste monomeren (het verlaagde monomeerconcentratie lijkt evenwel nadelig te veranderen de oppervlaktechemie van het resulterende polymeer is waarschijnlijk dat het molecuulgewicht en glasovergangstemperatuur wordt gewijzigd). Zeer vluchtige monomeren zijn ook moeilijk te gebruiken voorafgaand door de snelle verdamping van monomeer tot het UV hardingsstap bij polymeriseren. Afhankelijk van het aantal monomeeroplossingen een run kan maximaal 6 uur en aan het eind van de run vluchtige monomeren nemen verdampt zijn van de bron plaat. Gebruik van vluchtige monomeren kan worden bereikt door het koelen van de drukfase en met kleinere oplagen alleen. Met uitzondering van enkele zeer hydrofiele monomerenzoals poly (ethyleenglycol) acrylaat, de ontbinding van het verkregen polymeer spots in waterige buffers niet waargenomen, dus is het gebruik van een verknopend monomeer niet nodig, hoewel niet uitgesloten. 3. Polymer microarray vorming De typische procedure voor polymeer microarray vorming is schematisch weergegeven in figuur 1. Microarray vorming wordt bereikt door een contact robot (Biodot) met een XYZ fase (figuur 2). Slotted pinnen van 220 micrometer diameter worden gebruikt (Arrayit 96B). Alle kunnen worden gereinigd door sonicatie in dichloormethaan gedurende 10 minuten voorafgaand aan de oplage en ook de penhouder moet worden gereinigd. Kunnen worden geladen in de houder, blotting en matrix slides worden geladen en vervolgens de gehele kamer is gevuld met argon om het zuurstofgehalte tot minder dan 2000 ppm, die voldoende laag aan afschrikken van de polymerisatie radicalen voorkomen door zuurstof. De luchtvochtigheid wordt gehad op tussen 30-40%. Waaronder vochtigheid maakt de pHEMA zwellen waardoor het gevormde polymeer de pHEMA laag doordringen en fysiek ingesloten aan het oppervlak 2 worden. De oplage wordt begonnen. Elke run bestaat uit: Laden monster uit de bron plaat. De pennen worden neergelaten in de oplossingen met een snelheid van 25 mm / s gehouden in oplossing gedurende 2,5 s en vervolgens onttrokken met een snelheid van 25 mm / s (Figuur 2). Kunnen worden uitgewist voor afdrukken op monomeeroplossing uit de buitenkant van de pen. Vervolgens monomeer levering plaatsvindt van de quilled van de pen consistente vlekvorming. De gebruikte blotting volgorde bestaat uit 33 contacten met een schoon glasplaatje. Voor de eerste vier posities van het aantal gemaakte contacten 10, 5, 4 en 3. De volgende vier posities 2 contacten zijn gemaakt en in de laatste 3 posities 1 contact wordt gemaakt. Totale contacttijd voor elk contact is 10 ms en aanpak en de intrekking snelheid is 175mm / s. Op dit punt gevormde spots moeten een consistente vorm en geometrie. Het niet op dit punt geeft onreine pinnen of stof verontreiniging in het monomeer oplossingen. Het monomeer oplossingen worden vervolgens afgedrukt op het pHEMA beklede objectglaasjes (figuur 2). Een contact wordt per spot op pin beweging van 175 mm / s en contacttijd van 10 ms, die afhankelijk van de viscositeit en oppervlakte-energie van de monomeeroplossing geeft een gemiddelde spot diameter van 400 urn. Typisch 3 herhaalde arrays worden afgedrukt op elk glasschijfje en een totaal 10 slides worden op een enkele run. Dit komt overeen met 30 spots per cyclus. Kunnen worden gewassen in DMF. 2,5 L van vers DMF wordt voor de gehele run was. Kunnen worden gewassen in een stroom bad met agitatie. Gelijktijdig met het wassen worden de recent bedrukt dia bestraald met een korte golf UV (365 nm) bron met een dichtheid van 30 mV / cm 2 voor de duur van de periode was 30 s duurt. Eenfter alle monomeeroplossingen afgedrukt de arrays bestraald met UV (365 nm) gedurende nog eens 10 min. De vers gedrukte arrays worden gehouden bij lage druk (<50 mTorr) gedurende 1 week gepolymeriseerd monomeer en oplosmiddel te verwijderen. 4. Hoge doorvoer oppervlakte karakterisering (HTSC) Een opzet van het HTSC technieken is weergegeven in figuur 3. Centraal in de geautomatiseerde high throughput benadering is de uitlijning van het polymeer microarray de karakterisatie inrichting. In alle gevallen wordt dit bereikt met een camera die een bovenaanzicht van de array geeft. Aanvankelijk de array geroteerd te lijnen met de XY beweging van het podium. Een hoek spot van de array geplaatste en specifieke coördinaten. De positie van elk polymeer spot kan dan worden voorspeld met behulp van de afmetingen van de array. Watercontacthoek (WCA) metingen WCA metingen worden uitgevoerd met behulp van de sessiele druppel methode op eengeautomatiseerde Krüss DSA 100 instrument. Een druppel water met een volume van ~ 400 pL wordt aangebracht met een piezo-aangedreven printkop op elk polymeer spot. De diameter van een polymeer spot is typisch 300 urn diameter en de basis van de waterdruppel op het polymeer spot is typisch 100 urn dus slechts een meting kan worden verkregen polymeer per spot. Een kruistafel maakt de automatische positionering van elk polymeer spot onder de printkop 7. Dit wordt bereikt met een camera boven het monster dat een bovenaanzicht van de array geeft. Aanvankelijk moet de camerapositie worden aangepast aan de afgifte van de waterdruppel te centreren van het camerabeeld en de array kan worden aangepast aan de printkop. Een hoge snelheid camera registreert het zijprofiel van de druppel op het raken van het oppervlak en vervolgens verdampen. Het frame dat het initiële effect van daling vangt wordt gebruikt om de contacthoek te meten. Een cirkel is bevestigd aan de daling profile en de contacthoek vervolgens bepaald. Time-of-Flight secundaire ionen massaspectrometrie (ToF-SIMS) Monster geladen fase. Het gaat in de eerste plaats langs het podium met schoon Al folie, die helpt met extra betaling schadevergoeding, dan houdt de schuif op zijn plaats door het gebruik van metalen schroef tabbladen. Monstertafel is geplaatst in de overdrachtskamer van de ToF-SIMS en toegestaan ​​af te pompen tot 1,6 x 10 -6 mbar. Het monster wordt dan overgebracht naar de hoofdanalyse kamer, dat typisch een vacuüm van 1,0 x 10 -8 mbar. ToF-SIMS metingen worden uitgevoerd met een ION-ToF IV instrument uitgevoerd met een monoisotoop Bi3 + primaire ionen bron bedreven bij 25 kV in "gebundeld mode". Een gepulste 1 pA primaire ionen bundel wordt gerasterd tijdens de onderzochte gebied, met zowel positieve als negatieve secundaire ionen vanuit een 100 x 100 urn gebied van elk polymeer plek in de microarray voor een 10-sectweede acquisitie tijd. Ion massa's werden bepaald met behulp van een hoge resolutie Time-of-Flight analyser waardoor accurate massa opdracht. De typische massa resolutie (bij m / z 41) was net iets meer dan 6000. Lage energie elektronen (20 eV) werden gebruikt om te compenseren voor oppervlakte lading veroorzaakt door de positief geladen primaire ionen bundel op de isolerende oppervlakken 8. Atomic force microscopie (AFM) Een groot podium AFM met een automatische fase nodig voor het analyseren van arrays op het glaasje. Een dimensie of ICON microscoop is ideaal voor dit doel. Monster wordt geplaatst op het podium en het podium positie wordt geadopteerd om rechter bovenhoek van de array. De positie van de linker onderhoek van de array gevonden, waarmee de positie van alle andere plaatsen te interpoleren. Een positie lijst wordt gegenereerd en toegevoerd aan de auto-sampling van de software. AFM metingen worden genomen met behulp van een NanoScope 3000A instrument in te tikken mode. Silicon tips met een resonante frequentie van ongeveer 300 kHz en een krachtconstante 40 N / m gebruikt (Tap300Al, Budget Sensors). 5×5 urn gebieden van het polymeer gemeten 9. De root mean square (RMS) ruwheid wordt gemeten over deze regio voor elk beeld met behulp van SPIP batch-verwerking software. Elk beeld wordt in eerste instantie voorafgaand aan de meting van de ruwheid afgevlakt. Alle beelden hebben een handleiding bekijken om beeldvorming artefacten die mogelijk moeten worden verwijderd uit ruwheidsmetingen identificeren. Tijdens deze stap beelden kunnen ook worden ingedeeld gebaseerd op algemene oppervlaktekenmerken 9. X-ray foto-elektron spectroscopie (XPS) Een microarray dia wordt aangebracht op een monster bar met behulp van dubbelzijdige tape en vervolgens geladen in de monsterkamer van een Kratos Axis Ultra XPS instrument. Voer in de monsterkamer en wacht tot het bereiken van een druk van minder dan 10 -8 Torr. De juiste werkingparameters, zoals monochromated röntgenbron (Al, 1486,6 eV), anodepotentiaal en stroom (10kV en 15mA), apertuuromvang (110μm), pas energie (80 eV voor brede scan en 20 eV voor hoge resolutie scan) zijn geselecteerd. De röntgenbron gericht met behulp van twee tegenovergestelde hoeken van de microarray en het optimaliseren van de zuurstof signaal van het monster. De x-en y posities van individuele spots wordt bepaald en geregistreerd als een functie lijst. Een programma grafiek is geschreven en voer voor de verwerving van gegevens, met inbegrip van grote scans en scans met hoge resolutie voor specifieke elementen. Raman spectroscopie Raman spectra worden genomen voor elk polymeer plaatse middels een Raman microscoop LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon). Eerst wordt het Raman-signaal gekalibreerd met een silicium wafer en de Raman shift van Si op 520,7 cm -1. Het monster wordt vervolgens geplaatst op het podium en de focus van de laser (golflengte = 523 nm) wordt aangepast aan de CH Raman shift maximaliserenop 2950 cm -1. De positie van het midden van de linker vlek op de microarray wordt ingesteld als de oorsprong en een kaart van de microarray is ingesteld met behulp van de array-functie op de labRAM HR-software. 10 spectra cumulatief gemeten voor elk monster met een belichtingstijd van 0,5 s. 5. Bacteriële test De array kan worden blootgesteld aan verschillende biologische assays zoals hechting en proliferatie van stamcellen, andere types cellen en bacteriën 3,10,4. Hier beschrijven we een bacteriële aanhechting test, die schematisch is weergegeven in figuur 4. Een bacteriële stam getransformeerd met GFP expressie plasmide wordt een nacht bij 37 ° C in 10 ml LB media in een 50 ml falcon-buis onder schudden bij 200 rpm. De OD 600 van de bacteriekweek wordt gemeten en voldoende overnachtcultuur geïnoculeerd in 15 ml RPMI-1640 gedefinieerde media leidenin een uiteindelijke OD600 van 0,01. Arrays zijn voorwas ondergaan gesteriliseerd gedestilleerd water gedurende 10 minuten aan een oplosbare componenten te verwijderen uit de arrays (unpolymerised monomeer, oligomeren en oplosmiddel) Gewassen matrix glaasjes in een schone petrischaal en UV gesteriliseerd gedurende 10 minuten. Een dia met de array geplaatst in een petrischaal en 15 ml geënte RMPI-1640 media toegevoegd. Tegelijkertijd een dia geplaatst in een petrischaal en geïncubeerd met non-innoculatd RPMI-1640 als controle. Slides worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 72 uur onder schudden bij 60 rpm. Glaasjes tweemaal gewassen met 15 ml steriel PBS. Glaasjes tweemaal gewassen met 15 ml steriel gedestilleerd water. Slides zijn lucht gedroogd. Glaasjes afgebeeld met een GenePix Autoloader 4200AL Scanner (Molecular Devices, USA) met 488 nm excitatie en standaard blauwe laser emissiefilter (510-560nm). Een vertegenwoordiger polymeer autofluorescentie beeld isgetoond in figuur 2. Dit dient zo snel mogelijk aan het verval van de GFP voorkomen. Als dit niet mogelijk is de cellen te ondergaan fixatie. Bovendien is de opname van passende positieve controles met bekende bacteriële respons noodzakelijk kunnen de resultaten te normaliseren en proeven op verschillende dagen kwantitatief vergelijkbaar mogelijk. De totale fluorescentie-intensiteit van polymeer wordt verkregen met spots GenePix Pro 6 software (Molecular Devices, VS). Dit wordt zowel dia geïncubeerd met bacteriën en slechts media. De fluorescentie door de groei van bacteriën vinden de fluorescentie op het medium controle wordt afgetrokken van de fluorescentie gemeten op de dia geïncubeerd met bacteriën. Dia's kunnen ook worden gekleurd door 20 uM SYTO17 nucleïnezuur kleurstof (Invitrogen, UK) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en afgebeeld met een Carl Zeiss LSM 700 laser scanning microscoop met ZEN 2009 imaging software (Carl Zeiss, Duitsland). De dekking van bacteriënop het oppervlak wordt bepaald met behulp van open source Afbeelding J 1,44 software (National Institute of Health, VS). 6. Representatieve resultaten De voorwaarden van de boekdrukkunst zijn geoptimaliseerd om de hoogste kwaliteit polymeer microarrays af te drukken. De vochtigheidsgraad worden gehouden tussen 30-40%. De delaminatie van polymeer spots in waterige milieus werd vaak waargenomen voor arrays gedrukt bij een vochtigheid lager dan 30%, wat suggereert dat deze vochtigheid is onvoldoende om de laag pHEMA zwellen en voor de fysieke insluiting van het polymeer aan het substraat toe. De luchtvochtigheid kan verder worden verhoogd om de diameter van het polymeer spots veranderen, maar dit is afhankelijk van het monomeer chemie. Bijvoorbeeld, waar gelijke volumes van polymerisatieoplossing gedrukt en de vochtigheid werd verhoogd van 40 tot 80% vlekdiameter daalde van 430 urn tot 370 urn voor een monomeer met een hydrofiele ethyleenglycol eenheid gelijk volume terwijl voor een monomer met een hydrofobe alifatische carbon ringstructuur plaatse diameter nam toe van 290 urn tot 350 urn (figuur 5). De polymerisatiegraad kan worden gecontroleerd met behulp van Raman spectroscopie de C = C Raman shift die wordt gedetecteerd bij 1640 cm -1, die worden genormaliseerd met de C = O Raman shift bij 1720 cm-1 te meten. De Raman spectra werd gemeten polymeer spots gepolymeriseerd verschillende UV blootstelling (Figuur 6). De C = C: C = O daalde als UV blootstelling verhoogd van 0 tot 50 s, waarna geen verdere daling van de C = C: C = O verhouding werd waargenomen met andere UV bestraling (figuur 6). Raman spectra werden gemeten polymeer spots gepolymeriseerd bij gevarieerd O 2 niveau en de C = C Raman shift werd waargenomen als de O 2 level werd verlaagd tot 2000 ppm, evenwel geen verdere vermindering werd waargenomen voor een O 2 niveau daaronder (figuur 7A ). Raman spectroscopie ook werd aangetoond dat het vacuüm extractie step om niet-gepolymeriseerde monomeer te verwijderen. Voorafgaand aan afzuiging de C = C Raman shift was groter voor het polymeer gepolymeriseerd bij 3300 ppm ten opzichte van 2000 ppm (Figuur 7A), maar na vacuümextractie de hoogte van het Raman shift onderscheiden is (Figuur 7B), suggereert alle monomeer gepolymeriseerd is verwijderd tijdens de extractiestap vacuum. Samenvattend polymerisatieomstandigheden omvatten een luchtvochtigheid van 30-40%, UV blootstelling meer dan 50 s bij een O 2 niveau onder 2000 ppm met een afzuiginstallatie stap na het afdrukken gedurende 7 dagen. Na het afdrukken en vacuüm extractie van het succes van de polymerisatie van polymeer plekken kan worden beoordeeld door een eenvoudige lichtmicroscoop te identificeren en afwijkende plek morfologie. Gewoonlijk moet vlekken rond en uniform, zoals in figuur 8 aan de linkerkant. De waarschijnlijke oorzaak voor een verandering in de geometrie is een beschadigd of onrein pin. Voor een klein aantal monomeer combinaties we hebben waargenomen misvormde spots voor eXample een centrale plek met een satelliet van kleine spots, getoond in figuur 8 rechts of spiegelei vorm waarbij een centrale plek boven op grote spot vlakker. Dit kan worden veroorzaakt door fasescheiding uit te drukken met betrekking tot verschillen in viscositeit, hydrofiliciteit, volatiliteit of oppervlaktespanning van de monomeren en suggereert dat het monomeer combinatie niet compatibel is met dit formaat. Aanvullende chemische mapping polymeer spots met technieken zoals ToF-SIMS is een belangrijke en soms noodzakelijk kwaliteitscontrole stap om de verdeling van de materialen "chemie in de spots en de matrix te bepalen. Deze techniek kan identificeren overmatige verspreiding van sommige materialen onzichtbaar door lichtmicroscopie en identificeren fasescheiding binnen afzonderlijke spots polymeer. Figuur 1. Schematische voorstelling van de verschillende stadia van de vorming van een polymer plek. Figuur 2. Schematische voorstelling van de methode van pin druktechnieken waarbij aanvankelijk laden van de pen met monomeer in een bron plaat vervolgens afzetten van het monomeer op een substraat door contact. De pen wordt door een XYZ robotarm. De inzet toont een typisch beeld van de autofluorescentie van een array na productie. Figuur 3. Schematische wijzen bijbehorende techniek HTSC en bioassays toegepast op de studie van polymeer microarrays. Figuur 4. Schema van de bacteriële hechting analyse. Figuur 5. Polymer stipdoorsnede afgedrukt gevarieerd vochtigheid voor twee verschillende monomeren: 4-tert-butylcyclohexylacrylaat en di (ethyleenglycol) ethyl ether methacrylaat. Figuur 6. De verhouding van de intensiteit van het Raman C = C Raman shift bij 1640 cm-1 en de C = O Raman shift bij 1720 cm -1 vanaf polymeer spots van 4-tert-butylcyclohexylacrylaat met verschillende UV blootstelling. De foutstaven gelijk een standaarddeviatie (n = 3). Figuur 7. Raman spectra gemeten polymeer spots van 4-tert-butylcyclohexylacrylaat afgedrukt O 2 verschillende niveaus aangegeven aan de linkerkant van elk spectrum (A) vóór en (B) na afzuiginstallatie. De verhouding van de intensiteit van het Raman C = C Raman shift bij 1640 cm-1 en de C = O Raman shift bij 1720 cm -1 </sup> wordt getoond aan de rechterkant van elk spectrum. Figuur 8. Een lichte microscopie afbeelding van twee polymeer vlekken. De spot links toont een goed gevormde spot, terwijl de spot rechts is een voorbeeld van een spot met een zeer ongelijkmatig verdeling van monomeer. De schaalstaaf is 500 pm.