Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali
Summary
Forniamo un protocollo per la coltura di neuroni dell'ippocampo altamente purificato da cervelli dei topi prenatale senza l'uso di uno strato di cellule gliali alimentatore.
Abstract
Culture primarie di ratto e murina neuroni ippocampali sono ampiamente utilizzati per rivelare meccanismi cellulari in neurobiologia. Isolando e crescente singoli neuroni, i ricercatori sono in grado di analizzare le proprietà relative al traffico cellulare, la struttura cellulare e localizzazione singola proteina utilizzando una varietà di tecniche biochimiche. I risultati di tali esperimenti sono fondamentali per testare le teorie riguardanti la base neurale della memoria e dell'apprendimento. Tuttavia, risultati inequivocabili di queste forme di esperimenti si basano sulla capacità di crescere colture neuronali con minima contaminazione da altri tipi di cellule cerebrali. In questo protocollo, si usa mezzi specifici per la crescita dei neuroni e dissezione attenta di tessuto embrionale ippocampale per ottimizzare la crescita dei neuroni sani minimizzando tipi cellulari contaminanti astrociti (cioè). Tessuti embrionali del mouse ippocampale può essere più difficile da isolare rispetto al tessuto roditori simili a causa delle dimensioni del campione per dissection. Mostriamo tecniche di dissezione dettagliata dei dell'ippocampo dal embrionali cuccioli di topo al giorno 19 (E19). Una volta che il tessuto dell'ippocampo è isolato, dissociazione dolce delle cellule neuronali si ottiene con una concentrazione diluita di tripsina e distruzione meccanica progettati per separare le cellule dal tessuto connettivo, fornendo minimo danneggiamento singole celle. Una descrizione dettagliata di come preparare pipette da utilizzare nella interruzione è inclusa. Placcatura densità ottimali sono previste per immuno-fluorescenza protocolli per massimizzare la cultura di successo cellulare. Il protocollo prevede una tecnica veloce (circa 2 ore) ed efficiente per la coltura di cellule neuronali di topo tessuto dell'ippocampo.
Protocol
Discussion
Colture di ippocampo sono stati utilizzati in biologia molecolare per oltre 20 anni. In linea di principio, colture neuronali può essere fatto da qualsiasi parte del cervello, culture dell'ippocampo hanno dimostrato di essere più popolari a causa dell'architettura relativamente semplice della popolazione di cellule nervose nell'ippocampo 7. Culture ippocampali sono tipicamente realizzati in fase avanzata di tessuto embrionale. Questo tessuto è più facile da dissociare e contiene un minor numer…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Michael Wooten per il suo aiuto nella preparazione del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
Referenzen
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
- Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
- Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
- Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
- Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
- Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
- Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
- Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
- Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).
