Ce protocole vidéo démontre l'isolement et l'expansion des cellules souches comme des cellules de glioblastome mutliforme résection chirurgicale humaine (GBM) tissu tumoral en utilisant la méthode de dosage Neurosphère culture.
Proche des cellules souches ont été isolées dans les tumeurs comme le sein, poumon, côlon, prostate et du cerveau. Une question essentielle dans toutes ces tumeurs, en particulier dans mutliforme glioblastome (GBM), est d'identifier et d'isoler la tumeur population cellulaire initiateur (s) pour enquêter sur leur rôle dans la formation tumorale, la progression, et les récidives. Comprendre la tumeur initier les populations de cellules fournira des indices pour trouver des approches thérapeutiques efficaces pour ces tumeurs. Le dosage de Neurosphère (NSA) en raison de sa simplicité et sa reproductibilité a été utilisée comme méthode de choix pour l'isolement et la propagation de nombreuses de cette cellules tumorales. Ce protocole illustre la méthode de culture Neurosphère à isoler et à étendre aux cellules souches dans la résection chirurgicale du tissu tumoral humain GBM. Les procédures comprennent une digestion chimique initial et de dissociation mécanique du tissu tumoral, et par la suite plaquage de la suspension cellulaire unique résultant de la culture NSA. Après 7-10 jours, primaire neurosphères du 150-200 m de diamètre peuvent être observés et sont prêts pour d'autres repiquage et d'expansion.
Pour isoler souches neurales et de cellules progénitrices d'adulte normal et le cerveau du fœtus 1, 2, 3, 4 et aussi une tumeur proche des cellules souches provenant de tissus de cancer comme le poumon 5, de la prostate 6, 7 et le cerveau maternel 8, 9 le dosage a été Neurosphère fréquemment utilisées comme la méthode de choix. L'utilisation de ce test simple et reproductible, on peut générer un nombre indéfini de cellules de tissu tumoral réséqué qui montrent les mêmes caractéristiques que les cellules souches somatiques; multipotence ex vivo, la capacité de créer de nouvelles tumeurs lors de l'implantation, et l'auto-renouvellement. Ces cellules pourraient être utilisées pour étudier la biologie fondamentale sur le cancer des cellules dont la cellule à cellule des interactions, et de la différenciation, la migration, l'invasion et la mort cellulaire. En outre, les tumeurs isolées proche des cellules souches de fournir un outil précieux pour étudier comment se forment les tumeurs, les progrès et rechutes et aussi de démêler les sous-tendent les mécanismes cellulaires dérivant qui pourraient éventuellement fournir des indications aux thérapeutiquesoptions.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions du Centre de Recherche en Floride tumeur cérébrale; Preston A. Wells Jr. Center for Therapy tumeur au cerveau.
Name of the reagent | Typ | Company | Catalogue number | Comments |
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
%0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
*MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
*HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
*Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
**DNase I | Reagent | Roche | 104159 | |
**Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD | 371610 | |
Petri Dish | Culture ware | BD Falcon | 353003 | |
Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.