Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

1. Cultura de células MDCK Cultura 5 milhões de células MDCK durante a noite em um-75 T centímetros 2 balão em 20 ml de RPMI1640 meio completo com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 estreptomicina ug / ml, 1 de piruvato de sódio mM, 5% de bicarbonato de sódio a 7,5% solução e 0,001% de β-mercaptoetanol em um 37 ° C incubadora infundido com 5,2% de CO 2. 2. PR8 infecção e coleta de LBA Desafio de camundongos C57BL / 6 por via intranasal com 5.000 PFU de PR8 vírus em PBS estéril, em um volume total de 30 uL através de uma narina. Realizar simulações de infecções utilizando apenas PBS estéril sem o vírus. Euthanize camundongos 0, 2, 4 e 7 dias após a infecção e cortar interior da cavidade torácica abrir e fazer uma 1 paralela incisão centímetros para a traquéia através de o pêlo do mouse para expô-la. Faça uma incisão na linha média sobre o aspecto proximal da traquéia. Infundir a traquéia com 0,5 ml de BSA PBS-1% e aspire a BAFluido L. Fluidos do líquido de LBA pode ser armazenado em -20 congelador C ° até ser usado. 3. Infecção por vírus e detecção de proteína de matriz viral (M2) com o Odyssey LI-COR Para quantificar os títulos virais usando infra vermelhas dye-conjugados anticorpos, colher as células MDCK a partir de T-75 cm 2 frascos e placa-los em óptica plana negra de fundo 96-bem (10.000 células por poço) ou 384-bem (5.000 células por poço ) placas. Cultura as células MDCK para durante a noite a 37 ° C em RPMI1640 meio completo e lavar duas vezes com soro-livre DMEM contendo BSA (0,2%, peso / volume), a penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 ug / ml), de sódio piruvato (1 mM), solução de bicarbonato de sódio (5% do 7,5%) e β-mercaptoetanol (0,001%). Incubar as células MDCK com líquido de LBA (50 ul para 96-bem placa, ou 10 uL para 384-bem de placas) ou PR8 vírus com títulos conhecidos em cada poço com volume igual (50 uL para 96-bem placa, ou 10 uL para 384 – bem placa) de meio de DMEM,contendo L-1-tosylamido-2-feniletil clorometil cetona (TPCK)-tratada de tripsina (0,2 ug / ml). Na sequência de 1 h de infecção, adicione 100 uL (96-bem de placas) ou 20 ul (384-bem placa), de 10 de% de FBS-contendo RPMI1640 meio completo a cada poço. Continuar a cultura de células MDCK para um outro h 16 de infecção; lavar as células MDCK duas vezes com 100 uL (96-bem de placas) ou 20 ul (384-bem placa) de PBS-1 solução de BSA% e fixar com 100 uL (96-bem de placas) ou 20 ul (384-bem placa) de paraformaldeído 1% para 5 min. Na sequência, que fixa, incubar as células MDCK mais adicional para 30 min com 100 uL (96-bem de placas) ou 20 ul (384-bem placa) de BSA PBS-1% para bloqueio. Após o bloqueio incubar as células MDCK durante 1 h com o anticorpo primário contra a proteína M2 (1:1000, diluída em PBS-1% de BSA). Use 50 uL per uL bem e 20 de anticorpo diluído por poço em 96-bem ou 384-bem placas, respectivamente. Lave as células MDCK thrice com 100 uL (96-bem placa de) Ou 20 ul (384-bem placa), do PBS-contendo 1% de BSA e incubar durante 1 h, com 50 uL (96-bem de placas) ou 20 ul (384-bem placa) de cabra anti-do mouse IRDye @ 800 anticorpo secundário ( 1:200 de diluição). Lave as células MDCK thrice com 100 uL de PBS-contendo BSA a 1%. Coloque as placas manchadas na plataforma de vidro leitura da LI-COR scanner Odyssey IR e definir o leitor para um 96 – ou a leitura da placa 384-bem. Blank poços de controlo negativo pode ser definido usando o software Odyssey LI-COR. Quantificar placa inteira ou poços selecionados dentro de placa utilizando LI-COR software Odyssey. Usando Ferramenta de Auto Shape, desenhe os limites de uma região-alvo (ROI) no meio de um poço de teste de 96 – ou 384-bem placas. Criação de ROI permite que o software para comparar os poços de fundo definidos para as amostras-vírus tituladas. Para definir o valor de referência para o ensaio inteiro, use um ROI de fundo. Introduzir as duas miras opostas fornecidos pelo software Odyssey dentro do ROI para mensuraçõesre a intensidade da fluorescência do outro lado da bem. Digitalizar placas usando 780 canal de nm para a detecção e de 680 nm como comprimento de onda de referência em um LI-COR scanner Odyssey IR. Uma vez que o comando 'Read' é ativado, as intensidades fluorescentes em intervalos uniformes do ROI serão medidos e os dados coletados pontos integrados. Um multiplicador desvio-padrão irá determinar o nível de sinal sobre a linha de base que está incluído na determinação ROI. Fluorescência de fundo irá ser quantificado a partir do anticorpo mock-infectado ou secundária controla por si só e será usado para estimar a intensidade integrada em poços de teste. Escolheu "intensidade integrada" para os cálculos, pois representa o volume de pixels líquido para um ponto definido individual e é independente do tamanho. Use a curva de standard a partir dos títulos de conhecidos virais para calcular os títulos virais de amostras de desconhecidos. Use uma curva de interpolação por muito tempo para precisamente calcular os títulos virais. Calcule o vtítulos de Iral nas amostras a testar por comparando-se os intensidades de as amostras de ensaio com a curva padrão. 4. Os resultados representativos Padronização de IR sistema de alta taxa de transferência à base de corantes de detecção viral PR8 vírus pode infectar as células MDCK;, por conseguinte,, nós usado estas células para desenvolver este ensaio. Nós medimos os títulos virais usando um anticorpo primário contra uma proteína de matriz influenza viral (M2). Em contraste com outras metodologias, nós utilizado um anticorpo secundário que é conjugado a um corante perto de-IR. Este método proporciona uma simples, automatizado PR8 determinação do título de vírus usando intensidade de fluorescência que é gerado durante a detecção da proteína M2. Depois de infecção pelo vírus influenza, a proteína M2 é traduzida, transportados e se acumula na célula de hospedeiros, incluindo a superfície da célula. Assim, a quantidade da proteína M2 representa um parâmetro de mensurável para determinar a quantidade do vírus. Comparando-se os intensidades de a partir deas amostras a testar com a curva padrão fornece a medição precisa dos títulos da reação virais. Para determinar a eficácia do método de fluorescência-based, nós culta 10 4 células MDCK / poço em câmara desliza durante a noite. PR8 unidades populacionais de virais de títulos de conhecidos foram adicionados para duplicar poços com as unidades de placa diferentes formadoras (PFU) e permitiu que para adsorver sobre as células durante uma hora. Células foram incubadas durante 16 h para permitir que o vírus para se propagar. Após este, as células MDCK em os slides de câmara foram fixadas com paraformaldeído a 1%, lavou-se e corados com anticorpo anti-M2 durante 1 h, seguido por AlexaFluor 488-conjugado anticorpo secundário para um h 1 adicional. Confocais análises microscópicas de células infectadas pelo MDCK demonstraram a monocamada aderente foi em grande parte intacta e a proteína PR8-derivada M2 foi abundantemente presentes no interior das células infectadas MDCK (Figura 1A). As células fluorescentes poderia ser detectado em infecções com os títulos virais preço tão baixo quanto 10 2 </sup>. Essas análises também revelaram que o número de células fluorescentes MDCK por poço foram diretamente proporcionais às crescentes PR8 títulos virais. Embora, a eficiência ótica do laser de argônio-Based de excitação fluorocromo proporciona imagens vivas iguais celulares, sua de sinal estreito para rácio de ruído e da autofluorescência das células renderizar quantificações virais extremamente difíceis, particularmente em titulações mais baixas. Portanto, para estabelecer um método de estimativa precisa viral foi empregado um sistema de detecção à base de corantes IR e sistema de quantificação. Células MDCK (10 4 / poço) foram cultivadas em placas de 96-poços, infectadas com PR8 e proteínas virais foram detectadas utilizando anti-M2 seguido por um anticorpo dye-conjugada IR secundário. O uso de anticorpo anti-M2 permitiu-nos para usar a intensidade antígeno-específica de fluorescência como uma métrica direta de quantidade viral. Para enumerar a intensidade de fluorescência, foi utilizado o LI-COR Odyssey baseada scanner IR. Este sistema utiliza dois canais laser-basdetecções ed IR para identificar fluoróforos e diferenciá-los do ruído de fundo. O canal de primeira excita em 680 nm e emite menos 700 nm, para a ajudar a quantificar o plano de fundo. O segundo canal detecta fluoróforos que excitam a 780 nm e emissão a 800 nm. Digitalização de PR8-infectados células MDCK em LI-COR Odyssey indicado um de fluorescência título de-dependente viral brilhante (Figura 1B). M2 positivos fluorescentes células MDCK eram claramente visível no interior do poços (Figura 1B). Uma correlação positiva da intensidade de fluorescência para título de vírus de partida a partir de 10 2 -10 5 PFU poderia ser observado de forma consistente. PR8 titulações virais mais elevado do que 10 chumbo PFU 6 à morte celular, o que define um limite superior para a sensibilidade do ensaio. Positividade Minimal, mas detectável consistentemente visto com 10 2 -10 3 PFU PR8 os títulos virais demonstraram a alta sensibilidade das tinturas de perto de-IR. A relação sinal-para-ruído foi determinada através da comparação do mock-infectados ou isotípicos-anticorpo tratados com células MDCK. Tanto a de esses controles resultou em níveis negligenciáveis ​​ou indetectáveis ​​de fluorescência (Figura 1B). Para melhorar ainda mais a sensibilidade e para reduzir os de teste requisitos de volume da amostra, nós infectou 5 × 10 3 células MDCK / poço em 384-bem placas. PFU diferentes de PR8 foram testados como seriais um diluições de log (Figura 1C). Sensibilidade de detecção a partir de chapas 384-bem foi comparável à que a dos ensaios de 96-poços de placas. Tanto a 10 1 e 10 2 PFU trabalhou consistentemente melhor nas placas de 384-bem em comparação com 96-poços placas. Usando as intensidades de fluorescência a partir de 96 – ou formatos de placa 384-bem, nós construídas curvas de titulação padrão (Figura 1D). Nestes cálculos, a primeira variável é o título viral enquanto a variável segundo é a intensidade de fluorescência. Portanto, nós utilizamos a distribuição exponencial para gerar uma curva-se encaixam para determminar a relação polinomial entre os títulos virais e intensidades de fluorescência. Nós também têm validado as nossas observações usando outro anticorpo que é dirigido contra a nucleoproteína (NP), do PR8 vírus (dados não mostrados). Fontes distintas de PR8 cepas também foram utilizados para infectar as células MDCK que foram testados com anti-NP ou anti-M2 anticorpos (dados não mostrados). Colectivamente, podemos concluir que IR à base de corantes sistema de detecção de proteína pode ajudar a diagnosticar infecção cepas virais e enumerar precisamente o título dos patógenos infectantes. Considerações matemáticas para calcular os títulos virais Os cálculos matemáticos de intensidade de fluorescência e determinações titer são feitas como descrito abaixo. Após o procedimento de coloração, placa inteira ou poços selecionados dentro de placa são quantificados utilizando LI-COR software Odyssey. Usando Shape Tool Auto, limites de uma região-alvo (ROI) foi desenhado no meio dos poços de teste de 96 – ou 384-nósplacas de odas (Figura 2A e B). Criação de ROI permite que o software para comparar os poços de fundo definidos para as amostras-vírus tituladas. Um ROI de fundo foi usado para definir o valor de referência para o ensaio todo. Dois opostas cruz cabelos (branco) foram introduzidos dentro do ROI para medir a intensidade da fluorescência do outro lado da bem (Figura 2C). Curves para o lado direito e abaixo dos poços representativos nos Figura 2C representam a intensidade dos pixels ao longo estes cabelos transversais. As intensidades fluorescentes em intervalos uniformes de o ROI foram medidos e os pontos de dados coletados foram integrados. Um multiplicador desvio-padrão determinou o nível de sinal sobre a linha de base que foi incluído no a determinação ROI. Plano de fundo de fluorescência foi quantificada a partir do anticorpo mock-infectado ou secundária sozinho controles e usado para estimar a intensidade integrada em poços de teste. Nós escolheu intensidade integrada para cálculos porque ele REPRESentos de volume líquido de pixel para um local individual definido e é independente do tamanho. Além disso, intensidade integrada é substancialmente independente da sua resolução. Intensidade total / pixel (I) corresponde à intensidade de sinal decorrente da. Selecionado bem na área de pixel (Is) plus o sinal decorrente do plano de fundo da área do pixel (b) Portanto, para pixel 'i': I i = I s i + b i Volume de pixel representa tanto a magnitude o do sinal e a área na qual ele é distribuído. Área de sinal está relacionado com a distribuição de amostra que está gerando o sinal. O volume pixel é igual a de sinal total medido em pixel `mim 'no a área (um), do o pixel vezes a sua altura (I). Assim, por pixel 'i': vi = um I i De volume total de pixels de é o somatório de sinal total a partir de toda a área, assim,: ; n n V = Σv i = aΣI i i = 1 i = 1 Intensidade integrada é a soma dos valores de intensidade de todos os pixels delimitadas pelas recurso, multiplicado pela área do círculo / retângulo (contagem de milímetro 2). Por conseguinte, a intensidade integrada = a (ΣI i – b) Aqui, b stands para a intensidade média de fundo pixel. Esta fórmula calcula as intensidades de sinal integrados de o controlo ou a poços experimentais e, assim, estabelece uma curva padrão. Os títulos virais nas amostras a testar foram calculados usando esta curva padrão. Operação de concentração (de intensidade) é definida como a quantidade de presente de fluorescência em um ROI definido. Concentrações em amostras de teste são cálculosted parente para as concentrações no definidos de as normas em a mesma imagem. Para calcular os títulos precisos virais, a intensidade de cada padrão de concentração é plotado, e equipados com uma curva de interpolação longo. As concentrações de as amostras de ensaio são calculados por comparação da intensidade de a área dentro da curva padrão. Determinação de títulos virais a partir de líquido de LBA de camundongos de influenza infectados Detecção de partículas de influenza vivos virais em espécimes clínicos e de laboratório é de significância crítico. Portanto, o próximo examinar se podemos utilizar esse método para determinar os títulos virais em amostras de laboratório. Fluidos do líquido de LBA foram coletados a partir de camundongos não-imunizados e incrementados com uma quantidade conhecida de PR8 vírus. Cravadas fluidos do LBA foram linearmente ajustada para enumerar os títulos virais. Alíquotas de spiked fluidos do LBA foram utilizados para infectar células MDCK em placas de 96-poços, fixados e corados com anti-M2 e IR secondar dye-conjugadaanticorpos y. Resultados mostrados na Figura 3A demonstrar que os títulos virais no fluido spiked BAL eram detectáveis ​​e correlacionados com os PR8 títulos na da curva padrão. Usando a curva padrão, precisos números de virais em o fluido spiked e titulada BAL foi quantificado. Cálculos de ajuste exponencial de curva forneceu uma medida para calcular os títulos virais no fluido spiked BAL (Figura 3B). Através deste método que nós obtidas correlações de excelentes entre os títulos de calculadas e spiked virais, validando esta abordagem (Figura 3C). Em seguida, analisamos o LBA de PR8 camundongos infectados. PR8 tem sido extensivamente utilizado em modelos murinos para compreender 3 a imunidade humana patologia e anti-viral. Grupos de camundongos foram por via intranasal infectado com 5.000 PFU de PR8. Os ratos foram monitorados quanto à perda de peso, aparecimento de corcunda, de pele enrugada e outros sintomas clínicos. Em dias de 0, 2, 4, 7 e 10 de infecção pós,camundongos foram sacrificados e fluidos do líquido de LBA foram coletados. Para utilizar essas amostras de laboratório, as células MDCK foram incubadas com diluições seriadas de líquido de LBA em um volume final de 50 uL para 17 h em 96-poços placas. Poços de controlo de células MDCK infectados com títulos conhecidas de estoque de vírus PR8 servido para gerar uma curva padrão. Após a infecção, as células foram lavadas, fixadas e coradas com anticorpo anti-M2 primária, seguidos de perto de-IR anticorpo dye-secundário conjugado. Células MDCK que eram mock-infectado ou tratados com controles isotípicos após a infecção desde que as intensidades de fluorescência do fundo para os cálculos de titulação. Análises de o fluido de BAL demonstrado que PR8 vírus no espécime de laboratório é detectável através do sistema de ensaio de IR corante-Based. Um aumento significativo na a carga viral no líquido de LBA foi observada nos dias 2 e 4 de infecção pós (Figura 4A). Os cálculos de intensidade integrada indicado que os fluidos de LBA dos dias 2 e 4 de postar infection continha níveis significativos de PR8 vírus (Figura 4B). Nossos resultados mostram uma perda de peso gradual, mas significativa durante a fase precoce de PR8 infecção, demonstrando a gravidade da doença. Não obstante, a maioria dos mouses começou a se recuperar a partir de sintomas da doença e ganhando peso 7 dias após a infecção (Figura 4C). Mice at dia pós infecção 10 carecia de qualquer PR8 detectável indicando o apuramento de o vírus, que também, correlacionada com o aumento no peso corporal e as reduções consideráveis ​​nos sintomas da doença. Para ampliar ainda mais a aplicação do presente ensaio, testou-se um 2009 a influenza A (H1N1) isolado humano com IR sistema de detecção à base de corantes de anticorpos e comparadas com real-time PCR. Esta amostra clínica foi isolado a partir de um swab combinado nasofaríngea / garganta obtido a partir de paciente suspeita. O isolado foi propagado em linhagem de células MDCK na Saúde Milwaukee Departamento de Laboratório. Os resultados do teste eram compavermelho para verificar a sensibilidade do método à base de corantes IR a ensaios de PCR em tempo real (Figura 5). Os resultados indicam que o IR à base de corantes sistema de detecção de anticorpo tem o potencial de detectar a carga viral preço tão baixo quanto 10 3 TCID 50 / ml, o que é comparável à técnica de PCR-baseada em ensaio de (10 TCID 50 / ml) e queda no prazo de a relevância clínica gama para a maioria das amostras de doentes. Estes resultados fornecem forte evidência de que o sistema de análise IR à base de corantes tem sensibilidade suficiente e potencial para ser aplicado para a enumeração título viral em laboratório de pesquisa e na clínica. Figura 1. IR de detecção à base de corantes imune do vírus da gripe. (A) confocais análises microscópicas de influenza infectadas por células MDCK em slides 8-bem de câmara. De imunofluorescência análises microscópicas demonstrar a monocamada aderente MDCK é em grande parte intacta e carregado com o vírus da-derivada M2 proteína. (BC) Quantificação dos títulos virais baseados em IR corante e LI-COR sistema Odyssey. (D) Geração de curvas padrão e exponencial curva de ajuste-perfis. Dados apresentados no AD são representativos de cinco experimentos independentes. Figura 2. Metodologia de determinar os títulos virais utilizando corantes de IV. (A) Integrated medições de intensidade de fluorescência. Uma área definida no interior do poços de teste (ROI) foi marcado para medir as intensidades de fluorescência. Usando Shape Tool Auto, fronteiras de o ROI foram desenhada no meio de nos poços de teste de 96 – ou 384-bem placas. De fluorescência foi medida como pixels individuais (pixel = n) dentro do ROI. Intensidade integrada é a soma dos valores de intensidade de todos os pixels delimitadas pelas recurso, multiplicado pela área do círculo / retângulo (contagem de milímetro 2). (B) Determinando as intensidades integradas de fluorescência em poços do ensaio. Criação de ROIpermitiu que o scanner LI-COR para comparar os poços de fundo definidos para as amostras-vírus tituladas. Plano de fundo de fluorescência foi quantificada a partir do anticorpo mock-infectado ou secundária sozinho controles e usado para estimar a intensidade integrada em poços de teste. (C) Recolha de pontos de dados dentro do ROI. Dois opostas cruz cabelos (branco) foram introduzidos dentro do ROI para medir a intensidade da fluorescência do outro lado da bem. Curves para o lado direito e abaixo dos poços representativos representam a intensidade dos pixels ao longo estes cabelos transversais. Figura 3. Detecção e quantificação de os títulos de vírus em PR8 spiked fluidos do líquido de LBA. (A) células MDCK foram cultivados em placas de 96 poços durante a noite e adicionado com PR8-spiked líquido de LBA. As placas foram lidas no sistema de Odyssey LI-COR. (B) de fluido spiked exogenamente BAL foi comparado com curvas padrão. (C) Comparação de calculado vir ao esperado títulos de al. Ajuste de curva exponencial desde y = 9.4784e 0.0014x. Os dados apresentados no AC são representativos de três experimentos independentes. Figura 4. Detecção e quantificação de vírus da gripe em fluidos do líquido de LBA a partir de PR8 camundongos infectados. (A) Grupos de camundongos foram por via intranasal infectado com 5.000 PFU de PR8. Células MDCK foram incubadas com diluições seriadas de líquido de LBA em um volume final de 50 uL para 17 h em 96-poços placas. Após a infecção, as células foram lavadas, fixadas e coradas com anticorpo anti-M2 primária, seguidos pela IR anticorpo dye-secundário conjugado. O painel mais à direita representa a curva padrão. (B) Quantificação de títulos virais no líquido de LBA de camundongos infectados. (C) A perda de peso de camundongos durante PR8 infecção correlacionada com a carga viral. Os dados apresentados no AC são representativos de três experimentos independentes. re 5 "src =" files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg / "/> Figura 5. Detecção e quantificação de 2009 A (H1N1) pandemia (pdm) A gripe isolar a partir de um paciente humano. (A) O IR à base de corantes anticorpo de detecção sistema de fluorescência para meia-fold titulação de linha de célula infectada MDCK. Os resultados de fluorescência indicam o ensaio tem um potencial para detectar a carga viral preço tão baixo quanto 10 3 TCID 50 ml /. (B) O ácido nucleico extraído a partir de cultura isolar juntamente com seriais 10-de dobragem diluições de um H1N1 conhecidos titulado isolado de foram analisados ​​com o ensaio CDC PCR em tempo real 12. Limite de detecção em tempo real PCR foi de 10 DICC 50 / ml.