Determinazione dell'attività fagocitaria dei Campioni anticorpi clinici

1. Cellule cultura fagocitiche Cultura cellule THP-1 10 in RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale bovino come una sospensione stazionario in fiasche T. Densità cellulare deve essere mantenuta al di sotto 0.5×10 6 / ml al fine di mantenere livelli coerenti di espressione FcγR e performance test. 2. Preparare Antigen biotinilato Calcolare la quantità di solfo-NHS reagente kit LC biotina necessario biotinylate l'antigene bersaglio di interesse secondo le istruzioni del produttore. Sciogliere il reagente biotinilazione in acqua e aggiungere immediatamente l'importo calcolato per l'antigene in un buffer che non contiene ammine primarie. Lasciare che la reazione di procedere per 1 ora a temperatura ambiente, mescolando di tanto in tanto. Rimuovere i residui, biotina coniugata con uno scambio di buffer in un reparto di centrifuga concentrazione Amicon di un taglio appropriato peso molecolare per mantenere la Targeantigene t. Aggiungere campione alla camera superiore dell'unità concentrazione e aggiungere PBS per portare il volume totale di 15 ml linea di riempimento. Centrifugare a 4000 xg per portare il volume fino a circa 1,5 ml. Ripetendo questo processo due volte elimina il 99% della biotina gratuiti che assicurano la massima rivestimento di antigene di perline. 3. Preparare Perline Antigen saturi Lavare 100 l di 1 millimetro neutravidin perline fluorescenti due volte in 1 ml 0,1% PBS-BSA dopo riducendo la velocità in una microcentrifuga ad alta velocità. Risospendere lavato perle in 100 l di PBS-BSA, e aliquote in 10 tubi. Per determinare il rivestimento in condizioni antigene che saturano le perline, unire 10 ul della sospensione lavato tallone con diverse concentrazioni di antigene biotinilato in duplice passi. Incubare per una notte a 4 ° C in una provetta su un rotatore. NOTA: saturazione di perline devono essere determinati sperimentalmente. Questo può essere realizzatoidentificando bead-coating condizioni che producono la fagocitosi massima quando perline vengono successivamente opsonizzati con un anticorpo monoclonale di controllo. Rimuovere l'antigene non legato da un lavaggio con 1 ml di PBS-BSA e centrifuga ad alta velocità fino perle sono pellet. Rimuovere PBS-BSA e ripetere. Risospendere antigene perle rivestite in un volume finale di 1 ml in PBS-BSA. Perle possono essere conservati per un massimo di una settimana a 4 ° C prima dell'uso. 4. Preparare i campioni anticorpo Campioni di anticorpi clinici può essere purificato dal plasma utilizzando un gel kit Melone IgG purificazione secondo le istruzioni del produttore. IgG purificate possono essere conservati a 4 ° C fino al momento dell'utilizzo. NOTA: le opportune precauzioni per quanto riguarda la manipolazione di campioni umani devono sempre stata presa. Determinare la concentrazione di anticorpi purificati mediante assorbimento a A280, e diluire i campioni di 1 mg / ml in PBS. Preparare postulareive e negativo anticorpi monoclonali di controllo per diluizione di 1 mg / ml in PBS. 5. Placcatura l'esperimento Risospendere il lavato, soluzione satura di antigene tallone preparato in precedenza con il vortex, e trasferire 10 microlitri in ogni pozzetto di un fondo rotondo 96 pozzetti. Bisogna fare attenzione ad agitare continuamente la sospensione tallone per assicurare un numero uguale di perline fluorescenti sono aggiunti a ciascun pozzetto. Aggiungi concentrazioni variabili degli anticorpi di interesse in ogni pozzetto, creando una curva dose-risposta per ogni anticorpo. Concentrazioni ottimali variano tra i campioni a seconda del titolo di anticorpi presenti, ma una gamma di 0,01-100 mcg / ml concentrazione finale fornirà una buona copertura e permettere di identificare l'intervallo di concentrazione di interesse. Assicurarsi che gli anticorpi sono aggiunti in quantità non superiori a 20 l. Perle di incubare e campioni di anticorpi per 2 ore a 37 ° C per consentire al anticorpi opsonize le perline. </ Li> Preparare una sospensione di cellule THP-1 a 2,5 x 10 5 cellule / ml e aggiungere 200 ml di questa sospensione in ogni pozzetto, per un totale di 5 x 10 4 cellule THP-1 in ciascun pozzetto. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2, in un incubatore stazionario, le cellule permettendo e perline di pellet per gravità. NOTA: segnale al rumore può essere migliorata attraverso la determinazione del tallone ottimale: anticorpo: THP-1 rapporti di cella per una determinata sorgente antigeni e anticorpi. 6. Analisi in citometria a flusso Togliere 100 l di surnatante da ogni pozzetto facendo attenzione a non disturbare il pellet. Surnatante può essere salvato se determinazioni secrezione di citochine o altre analisi sono volute. Per il fissaggio, aggiungere 100 ml di paraformaldeide 4% in ogni pozzetto e pipetta per risospendere e mescolare cellule. Analisi dei flussi ad alta velocità citometria può essere eseguito utilizzando un BD LSR II dotato di un lettore di piastre HTS. Programma software per mixare ogni ben tre volte (100 volumi mix microlitri) e analizzare 30 microlitri, o almeno 2000 eventi cellula, di ogni campione. I dati raccolti possono essere analizzati in FlowJo o software equivalente. Metriche utili sono la percentuale di + tallone, o cellule fluorescenti, che fornisce una misura del numero dei fagociti presenti, così come l'intensità di fluorescenza delle cellule fagocitarie, che fornisce una misura del numero di perline fagocitati. Moltiplicando questi valori genera un sistema integrato di media intensità fluorescente, o iMFI. Il numero medio di perline fagocitati da ogni cellula fagocitica può essere calcolato dividendo il iMFI dalla fluorescenza media di 1 perlina. 7. Rappresentante Risultati Ci dovrebbe essere una chiara differenziazione dei campioni di anticorpi da parte di soggetti affetti e non. Figura 1A presenta gli istogrammi FACS di un campione di anticorpi da HIV negativozione (traccia nera) e un soggetto sieropositivo (traccia grigia), e dimostra la fagocitosi aumentato guidato dalla presenza di antigene-specifici anticorpi. Sensibilità ottimale del test dipende dalla saturazione delle perle con l'antigene biotinilato. Figura 1B presenta la fagocitosi osservata quando perle rivestite con differenti quantità di antigene sono stati opsonizzati con 3 anticorpi monoclonali di controllo (tra cui un non-legame degli anticorpi, triangoli), e stabilisce 2μg antigene / mL come perle di una concentrazione di saturazione per questo antigene. Una curva dose-risposta è illustrato nella figura 2, e dimostra la capacità differenziale di campioni anticorpo soggetti a indurre la fagocitosi su una gamma di anticorpi concentrazione di 0,05-5 mg / ml. Questo fagocitosi differenziale può essere guidata da due differenze di titolo o di proprietà del dominio Fc come sottoclassi di IgG e lo stato di glicosilazione. Quando cellule THP-1 sono iMaged al microscopio a fluorescenza, non c'è chiara evidenza di fagocitosi tallone. La figura 3 presenta due 63x immagini di cellule THP-1, dopo incubazione con anticorpi opsonizzati (verde) e non opsonizzati (rosso) perline, dimostrando la mancanza di assorbimento fagocitaria in assenza di anticorpi. Quando lasso microscopia volta che viene eseguito, l'anticorpo specifico per l'assorbimento fagocitica di perline fluorescenti è ancora più evidente (Movie 1, ingrandimento 20x). Il lavoro precedente ha confermato l'interiorizzazione delle perline associati con le cellule, e gli esperimenti con i monociti primari hanno concordato anche con punteggi fagocitica (valori iMFI) in questo saggio un throughput elevato (dati non riportati). Figura 1. Controllo Qualità di analisi. 1A, citometria a flusso istogrammi di fagocitosi per un campione di anticorpi di un soggetto HIV negativo (nero tracce) e un soggetto sieropositivo (traccia grigia).1B: Determinazione sperimentale delle condizioni ottimali di rivestimento tallone per un antigene del campione. Antigene-specifici anticorpi monoclonali (cerchio, quadrato) dimostrano fagocitosi massima di perle rivestite con> 2 mg antigene / l di perline, mentre un anticorpo di controllo (triangolo) dimostra nessuna attività fagocitaria. Figura 2. Fagocitosi curva dose-risposta. Campioni clinici degli anticorpi di HIV positivi (trattati, non trattati, e esibendo il controllo della replicazione virale in assenza di terapia antiretrovirale) e HIV negativi fagocitosi guidare soggetti di gp120 (busta HIV) perle di rivestimento differenziato. Figura 3. Internalizzazione efficiente. Microscopia conferma l'internalizzazione di anticorpi opsonizzati perline (verde), mentre non opsonizzati perle rimangono in soldistribuzione pesi (ingrandimento 63x). Movie 1. Time-lapse microscopia di anticorpi-driven fagocitosi è stata eseguita nel corso di 14 ore e permette di visualizzare l'attività fagocitaria del THP-1 le cellule utilizzate nel settore high-throughput test. Verde perline fluorescenti sono anticorpi opsonizzati, rosso perline fluorescenti forniscono un controllo negativo. Clicca qui per guardare il film.