Het bepalen van de fagocytaire activiteit of Clinical antilichaammonsters

1. Cultuur fagocyterende cellen Cultuur THP-1-cellen 10 in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum als een stationaire suspensie in T kolven. Celdichtheid dient te worden gehandhaafd onder de 0.5×10 6 / mL om samenhangende niveaus van FcγR expressie en de bepaling te handhaven. 2. Bereid gebiotinyleerd antigeen Bereken de hoeveelheid sulfo-NHS LC biotine reagens set nodig om de doelstelling antigeen van belang biotinylate volgens de instructies van de fabrikant. Los de biotinylatie reagens in water en onmiddellijk de berekende hoeveelheid toe te voegen aan antigeen in een buffer die niet bevat primaire amines. Laat de reactie om door te gaan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, mixen af ​​en toe. Verwijder overtollig, niet-geconjugeerd biotine door de buffer-uitwisseling in een Amicon centrifugale concentratie-eenheid van een geschikt molecuulgewicht cutoff naar de targe te behoudent antigeen. Voeg het monster naar de bovenste kamer van de concentratie-eenheid en voeg PBS om het totale volume tot 15 ml vullijn. Centrifugeer bij 4000 xg om het volume omlaag te brengen tot ongeveer 1,5 ml. Herhaling van dit proces twee keer zal verwijderen 99% van de vrije biotine tot de maximale coating van antigeen ervoor te zorgen dat kralen. 3. Bereid Antigen Verzadigde Beads Was de 100 ul van 1 mm TL neutravidin kralen twee keer in 1 ml 0,1% PBS-BSA na het stoppen met draaien in een microcentrifuge op hoge snelheid. Resuspendeer gewassen kralen in 100 pi PBS-BSA, en aliquot in 10 buizen. Om te bepalen antigeen coating voorwaarden die de kralen verzadigen, combineren 10 ul van de gewassen kraal ophanging met verschillende concentraties van gebiotinyleerd antigeen in twee-voudige stappen. Incubeer overnacht bij 4 ° C in een microcentrifugebuis op een rotator. LET OP: De verzadiging van de kralen proefondervindelijk te worden bepaald. Dit kan worden bereiktdoor het identificeren van kraal-coating voorwaarden dat de maximale opbrengst fagocytose wanneer beads worden vervolgens opsonized met een controle monoklonaal antilichaam. Verwijder de niet-gebonden antigeen door te wassen met 1 ml PBS-BSA en centrifuge op hoge snelheid tot de kralen zijn pellets. Verwijder de PBS-BSA en herhaal. Resuspendeer antigen gecoate kralen in een eindvolume van 1 ml in PBS-BSA. Kralen kunnen worden opgeslagen voor maximaal een week bij 4 ° C vóór gebruik. 4. Bereid antilichaammonsters Klinische antilichaammonsters kan worden gezuiverd uit plasma met behulp van een meloen gel IgG zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Gezuiverd IgG kan worden opgeslagen bij 4 ° C tot klaar voor gebruik. LET OP: Juiste voorzorgsmaatregelen met betrekking tot de verwerking van menselijke monsters moet altijd genomen. Bepaal de concentratie van gezuiverde antilichamen door absorptie bij A280 en verdun monsters naar 1 mg / ml in PBS. Bereid ponerenIve en negatieve monoklonale antilichamen controle door verdunning tot 1 mg / ml in PBS. 5. Plating het Experiment Resuspendeer de gewassen, antigen verzadigde kraal bovenstaande oplossing bereid door vortexen, en overdracht 10 pi in elke well van een ronde bodem met 96 putjes plaat. Zorg moet worden genomen om voortdurend roeren de kraal schorsing gelijke aantallen fluorescerende kralen zorgen worden toegevoegd aan elk putje. Voeg verschillende concentraties van de antilichamen van belang aan elk putje, het creëren van een dosis-response curve voor elk antilichaam. Optimale concentraties zullen verschillen tussen de monsters afhankelijk van de titer van antilichamen aanwezig, maar een bereik van 0,01-100 ug / ml uiteindelijke concentratie zal een goede dekking te bieden en identificatie mogelijk maken van het concentratiebereik van belang. Zorg ervoor dat antilichamen worden toegevoegd in hoeveelheden niet groter dan 20 pl. Incubeer kralen en antilichaammonsters gedurende 2 uur bij 37 ° C zodat de antilichamen tegen de kralen opsonize. </ Li> Bereid een suspensie van THP-1 cellen op 2,5 x 10 5 cellen / ml, en 200 ul van deze suspensie aan elk putje toe te voegen, voor een totaal van 5 x 10 4 THP-1 cellen in elk putje. Incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO 2, in een stationaire incubator, waardoor cellen en kralen om pellet via de zwaartekracht. LET OP: Signaal-ruis kan worden verbeterd door het bepalen van de optimale kraal: antilichaam: THP-1 cel ratio's voor een bepaalde antigeen en antilichaam bron. 6. Flowcytometrische analyse Verwijder de 100 pi van supernatant uit elk putje en let niet naar de cel pellet te verstoren. Supernatant kan worden bespaard als cytokine secretie bepalingen of andere analyses gewenst zijn. Voor bevestiging, voeg 100 ul van 4% paraformaldehyde aan elk putje en pipet te resuspendeer en meng cellen. Hoge doorvoer flowcytometrische analyse kan worden uitgevoerd met behulp van een BD-LSR II uitgerust met een HTS-plaat lezer. Programma-software aan elk putje drie keer (100 pi mix volume) mix en analyseren 30 ul, of ten minste 2000 cellen evenementen, van elk monster. De verzamelde gegevens kunnen worden geanalyseerd in FlowJo of gelijkwaardig software. Nuttige statistieken onder meer het percentage van de kraal +, of fluorescerende cellen, die een maat voor het aantal van de fagocyterende cellen aanwezig is zorgt, evenals de fluorescentie-intensiteit van de fagocyterende cellen, die een maat voor het aantal gefagocyteerd kralen biedt. Vermenigvuldiging van deze waarden genereert een geïntegreerde betekenen fluorescentie-intensiteit, of iMFI. Het gemiddelde aantal van kralen gefagocyteerd door elke fagocyterende cel kan worden berekend door de iMFI door de gemiddelde fluorescentie van een kraal. 7. Representatieve resultaten Er moet duidelijke differentiatie van antilichaammonsters van de getroffen en onaangetast onderwerpen worden. Figuur 1A toont de FACS histogrammen van een antilichaam monster van een HIV negatieftieve (zwart trace) en een HIV-positief (grijze spoor) onderwerp, en toont de verhoogde fagocytose gedreven door de aanwezigheid van antigeen-specifieke antilichamen. Optimale gevoeligheid van de test is afhankelijk van verzadiging van de kralen met gebiotinyleerd antigeen. Figuur 1B toont de fagocytose waargenomen wanneer kralen bedekt met verschillende hoeveelheden van antigeen werden opsonized met drie controle monoklonale antilichamen (met inbegrip van een niet-bindend antilichaam, driehoeken), en stelt 2μg antigeen / ul kralen als een verzadigende concentratie voor dit antigeen. Een dosis-response curve is weergegeven in figuur 2, en toont het verschil in capaciteit van het onderwerp antilichaammonsters aan fagocytose veroorzaken meer dan een antilichaam concentratiebereik van 0,05 tot 5 ug / ml. Dit verschil fagocytose kan aangedreven worden door een van beide verschillen in de titer of Fc-domein eigenschappen, zoals IgG subklassen en glycosylatie staat. Bij het THP-1 cellen zijn iMaged door fluorescentie microscopie, is er duidelijk bewijs van kraal fagocytose. Figuur 3 geeft twee 63x stilstaande beelden van THP-1 cellen na incubatie met antilichaam opsonized (groen) en niet-opsonized (rood) kralen, waaruit het gebrek aan fagocytische opname in de afwezigheid van antilichaam. Bij de time lapse microscopie wordt uitgevoerd, het antilichaam-specifieke fagocytische opname van fluorescerende beads is nog opvallender (Film 1, een vergroting van 20x). Eerder werk heeft bevestigd internalisatie van de kralen in verband met de cellen, en experimenten met primaire monocyten hebben goed overeengekomen met fagocytaire score (iMFI waarden) in dit high throughput assay (gegevens niet getoond). Figuur 1. Assay Quality Control. 1A, Flowcytometrie histogrammen van fagocytose voor een antilichaam monster van een HIV-negatieve onderwerp (zwart trace) en een HIV-positieve onderwerp (grijze spoor).1B: Experimentele bepaling van de optimale bead coating voorwaarden voor een sample antigeen. Antigeen-specifieke monoklonale antilichamen (cirkel, vierkant) aan te tonen maximale fagocytose van kralen bekleed met> 2 ug antigeen / ul van kralen, terwijl een controle antilichaam (driehoek) toont geen fagocytische activiteit. Figuur 2. Fagocytose dosis-respons curve. Klinische antilichaam monsters van hiv-positief (behandeld, onbehandeld, en tentoonstellen controle van virale replicatie in de afwezigheid van anti-retrovirale therapie) en HIV-negatieve personen rijden fagocytose van gp120 (HIV enveloppe) gecoate kralen differentieel. Figuur 3. Efficiënt Internalisatie. Microscopie bevestigt de internalisatie van antilichaam-opsonized kralen (groen), terwijl de niet-opsonized kralen blijven in solution (63x vergroting). Film 1. Time-lapse microscopie van antilichaam-driven fagocytose werd uitgevoerd in de loop van 14 uur en maakt visualisatie van de fagocytische activiteit van de THP-1 cellen gebruikt in de high-throughput assay. Groen fluorescerende kralen antilichamen opsonized, rode fluorescente kralen zorgen voor een negatieve controle. Klik hier om de film te bekijken.