1. लगानेवाला तैयार (तालिका लगानेवाला और Buffers देखें.) 2. परफ्यूज़न Buffers तैयार (तालिका लगानेवाला और Buffers देखें.) 3. उपकरण और संज्ञाहरण तैयार 37 के लिए पानी स्नान, गर्म छिड़काव बफर का प्रयोग डिग्री सेल्सियस एक बफर के साथ भरा बीकर में जगह आउटलेट वाल्व. बफर के साथ एक 50 मिलीलीटर सिरिंज भरें और लगानेवाला टयूबिंग के लिए देते हैं. टयूबिंग को खदेड़ने और बफर वापस द्वारा बार – बार एक रंग के ताशों का जोड़. बफर के साथ लाइन साफ़ तक टयूबिंग में सभी हवाई बुलबुले को समाप्त हो जाते हैं. यह लाइनों के किसी भी हवाई बुलबुले नहीं है के छिड़काव की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. सिरिंज निकालें और 4% paraformaldehyde के कमरे के तापमान लगानेवाला कंटेनर कनेक्ट. टयूबिंग अंत में हवाई बुलबुले से बचने, निचोड़ ट्यूब जबकि कंटेनर में ट्यूब स्थिति इतनी है कि अंत टी से बफर protrudes की एक बूंदकंटेनर के भीतर तरल पदार्थ सतह से संपर्क ओ. आउटलेट बंदरगाह (सुई अंत) को बंद करें. बारी से लगानेवाला वाल्व (सफेद) के रूप में एक ही स्थिति के लिए बफर वाल्व (नीला). यह केवल बफर लाइन से प्रवाह की अनुमति होगी. आउटलेट बंदरगाह खोलें और बफर लाइन भरने के लिए A3 के माध्यम से A1: कदम दोहराएँ. के बाद सभी हवाई बुलबुले के पास आउटलेट बंदरगाह का सफाया कर रहे हैं, सिरिंज को हटाने और बफर कंटेनर कनेक्ट ख्याल रख रही टयूबिंग में हवाई बुलबुले नहीं परिचय. रबर दबाव नापने का यंत्र रोना पंप द्वारा दबाव धारण करने की क्षमता के लिए परीक्षण प्रणाली. वहां आम तौर पर कुछ सिस्टम में हवा के संपीड़न के कारण प्रतिरोध है. उपयोग के लिए आसान के लिए आदेश में शल्य चिकित्सा उपकरण सेटअप. बफर के छिड़काव सुई के साथ भरें हवाई बुलबुले की संभावना को खत्म करने. सर्जरी से पहले, एक मिश्रण / ketamine xylazine (80 मिलीग्राम / किग्रा वजन शरीर ketamine और 10 मिलीग्राम / किग्रा वजन शरीर xylazine) intraperitoneal इंजेक्शन (27 गेज सुई और 1 सीसी सिरिंज के) के माध्यम से प्रशासित किया जाता है. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के अतिरिक्त प्रशासन प्रत्येक आपरेशन के दौरान संज्ञाहरण के एक शल्य विमान को बनाए रखने के दौरान आवश्यक के रूप में प्रदर्शन किया जाएगा. 4. छिड़काव सर्जरी एक बार जानवर संज्ञाहरण के एक शल्य विमान तक पहुँच गया है, कुचल बर्फ से भरा उथले ट्रे पर जगह है. पैर की अंगुली (चुटकी – प्रतिक्रिया विधि का प्रयोग करें संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण पशु जारी रखने से पहले अनुत्तरदायी होना चाहिए.). आवरण और रिब पिंजरे के नीचे पेट की दीवार के माध्यम से एक 5-6 सेमी पार्श्व चीरा बनाते हैं. डायाफ्राम से ध्यान से जिगर अलग. घुमावदार, कुंद कैंची का उपयोग डायाफ्राम में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. और अपनी उंगली की स्थिति दबाव को डायाफ्राम कटौती करने की क्षमता में सहायता कर सकते हैं. रिब फुफ्फुस गुहा बेनकाब पिंजरे की पूरी लंबाई के साथ डायाफ्राम चीरा जारी रखें. पसलियों के एक पक्ष के साथ घुमावदार, कुंद कैंची रखें, ध्यान से फेफड़ों को विस्थापित, और घनरिब पिंजरे के माध्यम से हंसली के लिए टी. Contralateral पक्ष पर एक इसी तरह की कटौती करें. उरोस्थि दूर भारोत्तोलन, ध्यान से किसी भी दिल को जोड़ने के ऊतकों ट्रिम. Hemostat साथ उरोस्थि की नोक दबाना और सिर पर hemostat जगह है. जब ठीक से किया है, थाइमस, उरोस्थि साथ साथ दिल से दूर हटाया, प्रमुख वाहिकाओं की एक स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करते हैं. बाएँ वेंट्रिकल का उपयोग परितारिका कैंची के पीछे अंत में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . आरोही महाधमनी में कटौती निलय के माध्यम से एक 15 गेज कुंद या जैतून इत्तला दे दी छिड़काव सुई से गुजरती हैं. टिप महाधमनी की दीवार के माध्यम से दिखाई होना चाहिए, और महाधमनी चाप जहां बाहु और मन्या धमनियों हट जाना तक पहुंच नहीं होना चाहिए. Hemostat का उपयोग करने के लिए दिल दबाना, इस सुई सुरक्षित है और रिसाव को रोकता है. अगर वांछित है, संशोधित hemostat सुई टिप के आसपास महाधमनी दबाना (इन hemostats जगह में रहते हैं जब तक विच्छेदन शुरू होता है, लेकिन स्पष्टता के लिए भविष्य चित्र से लोप कर रहे हैं) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, पशु सही परितारिका कैंची का उपयोग आलिंद अवरोही महाधमनी को नुकसान पहुँचाए बिना संभव के रूप में एक दुकान के रूप में बड़े बनाने के लिए एक चीरा बनाने के. इस बिंदु पर पशु perfused करने के लिए तैयार है. 5. छिड़काव खोलें और सुई देखभाल लेने के लिए किसी भी हवाई बुलबुले नहीं परिचय आधार आउटलेट बंदरगाह देते हैं. 80 मिमी Hg के एक जल्दी से और समान रूप से दबाव नापने का यंत्र बल्ब पंप. बफर जलसेक अवधि के दौरान इस दबाव बनाए रखें. टाइमर शुरू. सुई कोण समायोजित करें. सुई के कोण एक अधिकतम प्रवाह दर (कोण समायोजन के साथ प्रवाह परिवर्तन नोट) की उपलब्धि के लिए महत्वपूर्ण है. शौकीन स्विचएर (नीला) वाल्व एक बार बफर लगभग समाप्त हो गया है (200 मिलीलीटर). द्रव स्पष्ट किया जाना चाहिए. जिगर का समाशोधन एक अच्छा छिड़काव का एक संकेतक है. जिगर में इस बिंदु पर स्पष्ट किया जाना चाहिए. अपने रिकॉर्ड के लिए समय से संकेत मिलता है. फिक्सेशन झटके सेकंड के भीतर मनाया जाना चाहिए, इस निर्धारण का सही समय माना जाना चाहिए. अपने रिकॉर्ड के लिए समय से संकेत मिलता है. दबाव धीरे – धीरे 130 मिमी 2 पारा की एक अधिकतम करने के लिए बढ़ाने के लिए एक सतत प्रवाह दर को बनाए रखने कर सकते हैं. आउटलेट वाल्व बंद एक बार लगानेवाला लगभग समाप्त हो गया है. अपने रिकॉर्ड के लिए समय समाप्त होने का संकेत मिलता है. चूहे इस स्तर पर कठोर होना चाहिए. इस्तेमाल किया paraformaldehyde एकत्र किया जाना चाहिए है और अपनी संस्था के नियमों के अनुसार संग्रहीत निपटान के लिए. 6. 4,11 विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर सिर निकालें. गर्दन से नाक के आवरण के साथ एक midline चीरा और बेनकाबखोपड़ी. शेष गर्दन की मांसपेशियों को छाँटो इतनी है कि खोपड़ी के आधार संपर्क में है, किसी भी अवशिष्ट कैंची या rongeurs का उपयोग मांसपेशियों को दूर. एक तरफ रंध्र मैग्नम में परितारिका कैंची की एक जोड़ी की तेज अंत प्लेस, ध्यान से खोपड़ी के भीतरी सतह के साथ कैंची फिसलने. अगले, एक कट पीछे खोपड़ी की सतह के बाहर किनारे करने के लिए प्रदान करते हैं. Contralateral तरफ एक समान कटौती करें. सेरिबैलम के आसपास खोपड़ी स्पष्ट rongeurs का प्रयोग करें. ध्यान से खोपड़ी के भीतरी सतह के साथ कैंची स्लाइड के रूप में टिप लिए पृष्ठीय बाहर पीछे कोने से खोपड़ी के बाहर ललाट किनारे करने के लिए यात्रा, ब्लेड पर ऊपर उठाने के रूप में आप मस्तिष्क को नुकसान को रोकने के लिए काट रहे हैं. विपरीत पक्ष के लिए दोहराएँ. खोपड़ी की पृष्ठीय सतह छील rongeurs दूर का प्रयोग दिमाग से. दूर खोपड़ी rongeurs का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह के पक्ष को छाँटो. एक रंग का उपयोग करना है, घ्राण बल्ब और तंत्रिका कनेक्शन तोड़मस्तिष्क के उदर की सतह के साथ माहौल. धीरे मस्तिष्क सिर से दूर, किसी भी ड्यूरा कि अभी भी परितारिका कैंची का उपयोग खोपड़ी मस्तिष्क जोड़ता तंग trimming के. मस्तिष्क निकालें और यह लगानेवाला युक्त तरल पदार्थ कम से कम 10x ही मस्तिष्क की मात्रा की एक शीशी में डाल दिया. शीशी कभी कभी भंवर. 7. पोस्ट – निर्धारण और संग्रहण लगानेवाला में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मस्तिष्क रखने के लिए, कभी कभी घूमता. 24 घंटे के बाद, फॉस्फेट के साथ मस्तिष्क धो मीडिया 3 बार का आदान प्रदान और हर बार घूमता खारा बफर. दिमाग तो फॉस्फेट में संग्रहित किया जा सकता है खारा सोडियम azide साथ या HBHS बफर और 4 में रखा डिग्री सेल्सियस 8. प्रतिनिधि परिणाम छिड़काव की सफलता का एक प्रारंभिक सूचक extremities के रूप में नाक, कान, और पंजे और thymus ग्रंथि और जिगर (आईएचसी विश्व) के रूप में आंतरिक अंगों को साफ है.मस्तिष्क की सकल निरीक्षण (सफेद पीला पीला उपस्थिति) रक्त के रक्त वाहिका शून्य से पता चलता है. यह भी धुंधला हो जाना और immunohistochemistry के लिए नियुक्त करना ऊतक वर्गों के भीतर सच हो जाएगा. छिड़काव के परिणाम की अंतिम सूचक ऊतकों में फैटी की हालत 1,6,7,8. लगानेवाला तैयार: 8% Paraformaldehyde स्टॉक तैयार 500 मिलीलीटर DH 2 ओ के लिए 40 ग्राम Paraformaldehyde जोड़ें 60 से हल गर्मी – 65 डिग्री सेल्सियस जबकि सरगर्मी (क्या 65 से अधिक डिग्री सेल्सियस, ऐसा करने पर प्रतिकूल immunohistochemical प्रक्रिया की सफलता को प्रभावित कर सकते हैं). स्पष्ट समाधान के लिए, गर्मी को कम करने और एक dropper के साथ 1.0 एम NaOH के 2-3 मिलीग्राम जोड़ें. फ़िल्टर और डिग्री सेल्सियस 4 में 1 महीने के लिए दुकान. 0.2 एम सोडियम फास्फेट बफर, 7.4 पीएच तैयार सोडियम फॉस्फेट अकेले आधार का स्टॉक, 1 एल DH 2 ओ 27.8 छ नः 2 पीओ 4 * एच 2 हे सोडियम फॉस्फेट द्विबेसीय स्टॉक के लिए, 1 एल DH 2 ओ 28.4 छ ना 2 4 HPO Dibasic स्टॉक के 190 मिलीग्राम के लिए एक भस्मक शेयर के 810 मिलीलीटर जोड़ें. 4% Paraformaldehyde की लगानेवाला तैयार बराबर भागों 0.2M सोडियम फास्फेट बफर करने के लिए 8% paraformaldehyde स्टॉक जोड़ें नोट: यह तय सबसे ताजा तैयार है अग्रिम में 72 घंटे से अधिक नहीं है,. परफ्यूज़न और भंडारण Buffers तैयार: फास्फेट तैयार खारा, 7.4 पीएच बफर 1 एल DH 2 हे 9 छ NaCl 144 मिलीग्राम के.एच. 2 पीओ <> उप 4 795 मिलीग्राम ना 2 4 HPO पीएच की जाँच करें HEPES सोडियम azide पीएच 7.4 के साथ हैंक्स समाधान (HBHS) के बफर 990 मिलीलीटर DH 2 हे 7.5 छ NaCl, 0.3 छ KCl 0.06 छ 2 के.एच. पीओ 4 0.13 छ ना 2 4 HPO 2 ग्राम Dextrose / ग्लूकोज 2.4 छ 10 मिमी Hepes 0.1 छ 2 MgCl 6 भागों DH 2 हे 0.05 छ MgSO 4 7 DH 2 हे भागों 0.165 छ 2 CaCl 2 भागों DH 2 हे 90 मिलीग्राम NaN 3 पीएच की जाँच करें तालिका 1 लगानेवाला और Buffers की तैयारी. आकृति 1. </stronजी परफ्यूज़न उपकरण> लेबल घटकों के साथ. चित्रा 2. परफ्यूज़न उपकरण मैं तैयार लगानेवाला लाइन के साथ शुरू करो. हवा बुलबुले की टयूबिंग फ्लश और तेजी से खदेड़ने और सिरिंज में बफर और लाइन के माध्यम से वापस बफर के साथ भरें. सुई अंत पर वाल्व बंद. हवाई बुलबुले के बिना शुरू लगानेवाला लाइन लगानेवाला बोतल में रखें. चित्रा 3 परफ्यूज़न उपकरण द्वितीय की तैयारी. 1. सुई के छोर पर वाल्व खोलें. 2. बफर वाल्व (नीला) बारी करने के लिए प्रवाह के लिए स्थिति. 3. हवा बुलबुले की टयूबिंग फ्लश और तेजी से खदेड़ने और सिरिंज के साथ वापस बफर बफर के साथ भरें. 4. सुई छोर पर वाल्व बंद करें. बफर बोतल में टयूबिंग रखें. टेस्ट करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रणाली सही बंद है बनाने के लिए दबावदबाव नापने का यंत्र बल्ब पंप और गेज देख ly. तंत्र अब छिड़काव प्रक्रिया के लिए तैयार है. चित्रा 4 बफर वितरण के लिए स्थिति में परफ्यूज़न उपकरण. चित्रा 5 परफ्यूज़न सर्जरी मैं एक) आवरण और पेट की दीवार के माध्यम से एक पार्श्व चीरा करें. ख) डायाफ्राम में एक चीरा और दिल को उजागर डायाफ्राम में कटौती. हंसली के लिए पसलियों के दोनों ओर समानांतर कटौती करें. ग) hemostat साथ उरोस्थि की टिप दबाना है और सिर पर hemostat जगह है. चित्रा 6 परफ्यूज़न सर्जरी द्वितीय. ) एक आरोही महाधमनी में कटौती निलय के माध्यम से छिड़काव सुई पास. ख) सुरक्षितछिड़काव दिल को दबाना hemostats की सुई का उपयोग एक सेट. एक संशोधित hemostat का एक दूसरा सेट भी सुई टिप में रिसाव रोकता है चारों ओर महाधमनी दबाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आईरिस कैंची का प्रयोग बाएं वेंट्रिकल के पीछे के अंत के लिए एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. 7 चित्रा बफर पम्प दबाव नापने का यंत्र के लिए लाइन में दबाव बनाने के बल्ब के साथ छिड़काव. वाल्व खोलें (1) और सुई हब के लिए देते हैं. यह सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले शुरू कर रहे हैं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. 80 मिमी Hg के एक दबाव नापने का यंत्र बल्ब और पंप बफर जलसेक अवधि के दौरान इस दबाव को बनाए रखने. 8 चित्रा बफर एक बार लगानेवाला साथ परफ्यूज़न लगभग समाप्त हो गया है (200 मिलीलीटर) बफर वाल्व (1) स्विच करने के लिए लगानेवाला के लिए प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं. दबाव धीरे – धीरे एक को बढ़ा जा सकता है130 मिमी Hg की अधिकतम. 9 चित्रा विच्छेदन मैं) कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर सिर को हटा दें. ख) गर्दन से नाक के midline के साथ त्वचा में एक चीरा बनाने के लिए और खोपड़ी बेनकाब. ग) शेष गर्दन की मांसपेशियों ट्रिम इतना है कि खोपड़ी के आधार संपर्क में है. सिर पकड़ ताकि कपाल सतह में एक बड़ी खोलने (रंध्र मैग्नम) पहुँचा जा सकता है. ध्यान से रंध्र मैग्नम में परितारिका कैंची की एक जोड़ी की तेज अंत डालने और एक काट कर. Contralateral पक्ष के लिए एक ही पैंतरेबाज़ी दोहराएँ. सेरिबैलम के आसपास खोपड़ी स्पष्ट rongeurs का प्रयोग करें. 10 चित्रा विच्छेदन द्वितीय. एक सावधानी से) खोपड़ी के भीतरी सतह के साथ कैंची स्लाइड. टिप पर लिफ्ट के रूप में आप मस्तिष्क को नुकसान को रोकने के लिए काट रहे हैं. एक ही दोहराना के लिएविपरीत दिशा. खोपड़ी छील rongeurs मस्तिष्क से दूर का प्रयोग करें. ख) खोपड़ी के साथ चित्रण हटा दिया है और मस्तिष्क अवगत कराया. ग) एक रंग का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क की सबसे पूर्वकाल स्थान पर घ्राण बल्ब और तंत्रिका कनेक्शन तोड़. ध्यान से मस्तिष्क के नीचे को हटायें की आसानी के लिए कनेक्शन को तोड़ साथ रंग टिप गाइड. मस्तिष्क निकालें और यह लगानेवाला की एक शीशी में डाल दिया.