Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen
Summary
Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.
Abstract
Lung dendritische cellen (DC) spelen een fundamentele rol in sensing binnendringende ziekteverwekkers 1,2 als in de controle van tolerogene reacties 3 in de luchtwegen. Ten minste drie belangrijke subsets van long dendritische cellen zijn beschreven bij muizen: de conventionele DC (CDC) 4, plasmacytoïde DC (PDC) 5 en de IFN-producerende killer DC (IKDC) 6,7. De CDC subset is de meest prominente DC subset in de longen 8.
De gemeenschappelijke marker bekend bij DC subsets te identificeren is CD11c, een type I transmembraan integrine (β2), die ook tot uitdrukking op monocyten, macrofagen, neutrofielen en een aantal B-cellen 9. In sommige weefsels, met behulp van CD11c als een marker voor muis-DC te identificeren geldig is, net als in de milt, waar de meeste CD11c + cellen vertegenwoordigen de CDC-subset die hoge niveaus van de belangrijkste histocompatibiliteitscomplex klasse II (MHC-II) uitdrukt. Echter, de long is een meer heterogeen weefsel waar wordenkant DC subsets, is er een hoog percentage van een afzonderlijke cel bevolking die hoge niveaus van CD11c uitdrukt bout lage niveaus van MHC-II. Op basis van haar karakterisering en meestal op de uitdrukking van F4/80, een milt macrofaag marker, heeft de CD11c hi MHC-II-lo long celpopulatie is geïdentificeerd als pulmonaire macrofagen, 10 en meer recentelijk, als een potentiële voorloper DC 11.
In tegenstelling tot de muis PDC, heeft de studie van de specifieke rol van CDC in de pulmonale immuunreactie te wijten aan het ontbreken van een specifieke marker die kan helpen bij de isolatie van deze cellen beperkt. Daarom is in dit werk beschrijven we een procedure om sterk gezuiverd muis long CDC isoleren. De isolatie van pulmonale DC subsets is een zeer nuttig instrument om inzicht in de functie van deze cellen te krijgen in reactie op respiratoire pathogenen alsmede milieu-factoren die de gastheer immuunreactie in de longen kan leiden.
Protocol
Discussion
Isolatie van pulmonale muis DC is een belangrijke techniek voor de studie van een breed scala van respiratoire stimuli. Het proces van het verkrijgen van deze cellen bevat cruciale stappen die het verlies van cellen en levensvatbaarheid van de cellen en zuiverheid te voorkomen. Perfusie van de long voor de collectie zal helpen om een perifere cellen te elimineren als contaminant erytrocyten te verminderen. Het gebruik van de geautomatiseerde dissociatie kan worden advanteogus wanneer een groot aantal van de longen…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag naar Marilyn Dietrich danken aan het LSU Flow Cytometry Core Faciliteit voor haar hulp met de cel sorteer-en Peter Mottram voor zijn hulp bij de microfoto's. Dit werk werd gefinancierd door de Flight Attendant Medical Research Institute, het LSU-Competitive Research Program Award, en de NIH / NIAID Subsidies P20 RR020159 en R03AI081171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD-Pharmingen | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
Referenzen
- Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science. 293, 253-256 (2001).
- Banchereau, J. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Manicassamy, S., Pulendran, B. Dendritic cell control of tolerogenic responses. Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).
- Asselin-Paturel, C. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).
- Chan, C. W. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity. Nat. Med. 12, 207-213 (2006).
- Taieb, J. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat. Med. 12, 214-219 (2006).
- Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections. Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).
- Larson, R. S., Springer, T. A. Structure and function of leukocyte integrins. Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).
- Sung, S. S. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).
- Wang, H. Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process. J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).
- Bhatia, S. Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype. PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).
- Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).
- Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection. J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).
