Изоляция и биофизических исследований фруктов кутикул

1. Ферментативный изоляция томата смазывают 5 Поместите несколько коммерческих или томатов в миску. Очистите кожу от фруктов в больших разделов, отбросить внутренние ткани околоплодника. Вымыть помидор скинов деионизированной водой и сохранить их под воду в стакане. Подготовьте 50 мМ рН 4,0 буферного раствора ацетата натрия (при 31 ° C), положив 1,22 г тригидрата ацетата натрия (М р. 136,08 г / моль) и 2,34 мл ледяной уксусной кислоты (17,485 м) в стакан, добавить 200 мл деионизированной воды, а затем отрегулировать рН до 4,0 при 31 ° C. Приготовить смесь, содержащую 4 мл пектиназы (EC 3.2.1.15, 10 U мл -1, TCI Америки), 0,2 г целлюлозы (ЕС 232.734.4; 1,3 ед / мг твердых, Sigma Aldrich) и 13 мг NaN 3, , а затем добавьте 196 мл натрий ацетатного буфера с ферментом смеси для получения 200 мл окончательного коктейль фермента 5. Полностью погрузиться очищенный помидор коже фермента коктейль и инкубироватьпри 31 ° С в течение 24 часов с постоянной тряски (G24 экологической инкубатор Шейкер, New Brunswick Scientific Co.) Соберите шкуры томат помощью фильтра кухне или Бюхнера воронку и промыть их дистиллированной водой. Затем поместите их в вакуумной печи при комнатной температуре в течение часа. Сохранение сухие шкурки помидор помечены, максимум бутылка для последующих процедур депарафинизации. 2. Исчерпывающая Депарафинизация по Сокслета Добыча 6 Оборудование, используемое для исчерпывающего депарафинизации состоит из источника тепла (нагрев мантии и Variac контроллер), круглодонную колбу для растворителя водохранилища, экстрактор Сокслета, спеченного стекла наперсток или одноразовый наконечник добычи, анти-натыкаясь чипов и конденсатор (см. рис. 1). Обратите внимание, что узкая рука сифон (части 6 и 7 на рис. 1) очень тонкая и склонна к поломке, требующей осторожного обращения. Положите 0,5-1 г томатной кожи (полученные вШаг 1.) в ступе, и измельчить образец грубого порошка с пестиком, если образцы будут использоваться для измерения АСМ (раздел 5). Заполните спеченного стекла или одноразовые наперсток примерно на полпути с образцом и использовать пинцет, чтобы поместить его в тайне на основании извлечения столбцов. Установите конденсатор и обернуть ее фольгой. Нагрейте метанол (ACS класса) в присутствии нескольких анти-натыкаясь чипов до кипения осторожно и отливы на стенках колбы. Накройте емкость с растворителем и стекловолокна и алюминиевой фольги. Проверьте процесс в течение часа, регулируя Variac напряжение так, чтобы резервуар накапливается около одной капле в секунду и отборе происходит в аппарате Сокслета, когда наперсток полон. Продолжить процесс извлечения в течение 12 ч, затем опустите отопления мантии и позволяет аппарату остыть. Снимите экстрактор и водохранилища, как единое целое, чтобы избавиться от растворителя. Используйте выщипыватьRS поднять наперсток чуть ниже шеи экстракционной колонны, слейте излишки растворителя из нее, и поместите наконечник на чистую поверхность. Наклоните экстракционной колонны, чтобы отборе в колбу ниже. Отключите колбу и заливают отходы в помечены отходы растворителей сосуд. Повторите шаги 2.3 и 2.4 для последовательного растворители постепенно уменьшается полярность, например, хлороформ и гексана в течение 12 ч в каждом конкретном случае. Дайте пример помидор кутина сушить в наперсток, либо дует поток азота над ним или, поместив его в вакуумной печи при комнатной температуре. Наконец, измерения массы сухого образца и храните его при комнатной температуре в завинчивающейся банке запечатанный парафильмом. 3. Селективного выделения эпикутикулы и Intracuticular воски 3,4 Во-первых, мыть все помидоры (отдельные партии томатов от описанных в 1.) С дистиллированной водой. Высушите их папэ полотенца и Kimwipes, и место их остановить вниз на лист алюминиевой фольги. Краска все помидоры с 120% (в / в, отношение масс) гуммиарабика в водном растворе сверху вниз моды и позволит около часа, гуммиарабик высохнуть на коже фруктов, оставляя тонкую пленку. Удалить пленку с помощью пинцета, стараясь не проколоть кожу томатным. Повторите эту процедуру еще раз. Добавить фильмов флаконах, содержащих 1:1 (объем / объем) хлороформ воды и перемешать в течение трех минут. После интенсивном перемешивании и фазовое разделение, пипетка из хлороформа фракций и их испарения в отдельных обнаружили флаконы, оставляя эпикутикулы воска. Помидоры останутся нетронутыми физически. Опустите их в хлороформе в течение двух минут при комнатной температуре и собирать intracuticular воска после испарения растворителя. Теперь, очистить от кожуры помидоры и относиться к ним ферментативно (с целлюлазы и пектиназы натрия ацетатного буфера) для удаления клетчатки и пектина, соответственно (как описано в <strОнг> 1). При необходимости, выполнить исчерпывающий депарафинизации на эти ферментативно изолированной кутикулы путем экстракции Сокслета (см. шаг 2), с помощью трех растворителях различной полярности (метанол, хлороформ и гексана, соответственно). 4. Молекулярная характеристика Томатный кутина фруктов по кросс-поляризации Magic-угол прядильной твердотельные ядерного магнитного резонанса (CPMAS ssNMR) 6 Место 4-6 мг полностью депарафинированных помидор кутикулы (cutins) в 1,6 мм fastMAS циркония ротора помощи от поставщика упаковки инструмента. (Или земля депарафинированных кутикулы помидор или очень маленькие кусочки частично депарафинированных кутикулы подходит.) Убедитесь, что образец упакован равномерно, но не слишком плотно, в роторе. После сдачи на верхней крышке, краска половине шапки с черными чернилами маркером для облегчения измерения скорости вращения. Отрегулируйте шиммирования ЯМР-спектрометра для минимальной ширины спектральной линии на половине высотый калибровки протона (1 Н) и углерода (13 C) 90 ° шириной импульса с использованием стандартного соединения, такие как адамантана. Использование глицина или глютамин в качестве модельных соединений, получить максимальную интенсивность сигнала за счет оптимизации всех параметров (Hartmann-Хан соответствующие уровни мощности, 1 H – 13 C время контакта, гетероядерных 1 H развязки прочности) кросс-поляризации магическим углом спиннинг (CPMAS) эксперимента. Для спектры, полученные в 1 H частотой 600 МГц, рекомендуется условия включают в себя 10 кГц или 15 кГц частотой вращается, 3-секундная задержка между приобретениями и спинного гетероядерных протон развязки 7 при напряженности магнитного поля эквивалентно частоте 185 кГц. Вставьте кутина упаковке ротора в зонд. Затем поместите датчик в магнит. Увеличить скорость отжима до 10 кГц постепенно, чтобы проверить хороший образец упаковки и ротор стабильности. Убедитесь, что окончательное вращающийся стабильность ротора с точностью до± 20 Гц. Установите настройки и соответствующие конденсаторы зонда итеративно до достижения минимальной отражающей способности как на 1 H и 13 C ЯМР. Установить экспериментальной температуры до 25 ° C (или комнатной температуры). Запустите предварительно оптимизированные CPMAS эксперимент соответствующие Hartmann-Хан соответствующие условия определяются на 10 кГц частотой вращается. Приобретать 4096 переходных процессов, состояние спектра с экспоненциальным (лоренцевой) уширение линий 50-100 Гц, и сделать преобразование Фурье для получения спектра ЯМР интенсивности сигнала от химической защиты (частей на миллион). Ссылка 13 С химические сдвиги извне с помощью адамантана набор на 38,4 промилле (-CH 2 – группа) 8 в качестве стандарта. Увеличение ротор, вращающийся частоты до 15 кГц и повторить измерения CPMAS (шаги 4.6-4.8), соответствующие Hartmann-Хан соответствующие условия определяются на последнем спиннинг частоты. REPEна CPMAS экспериментов (шаги 4.1-4.9) с естественным (восковой) и частично депарафинированных образцы фруктов кутикулы. 5. Зондирования поверхности кутикулы томатный с атомно-силовой микроскопии (цифровые инструменты Наноскоп IIIa, процедуры будут немного отличаться среди микроскопов) 6 Включите сканирующего зондового микроскопа (СЗМ) (рис. 2) и убедитесь, что микроскоп режиме переключатель установлен в контакте атомно-силовой микроскопии (АСМ) режиме. Вручную поднять голову СПУ, превратив его два пользовательских регулируемые ручки фронт. Снимите tipholder АСМ от СПУ голову, повернув зажимной винт в задней части головы. Используйте пинцет, чтобы удалить существующий консольный АСМ от tipholder, затем осторожно возьмите новый консольный нитрида кремния (АСМ зонд) из упаковки и установите ее на место старой консоли. С помощью светового микроскопа, чтобы убедиться, что вновь установленные АСМ-кантилевера не нарушена. Прикрепить йэлектронной помидор кутикулы образца (раздел частично депарафинированных помидор кутикулы ~ 10 мм х 10 мм) из нержавеющей стали диска (пример шайба) с двухсторонней ленты. С помощью светового микроскопа, чтобы убедиться, что кутикула поверхность остается ровной и гладкой после размещения образца на шайбу. Поместите шайбу с образцом помидор кутикулы на магнитные области в верхней части СЗМ сканер. Установите два передних ручной регулировкой винта сканер высокой поворотом ручки, установить моторизованных винт обратно корректировка примерно на том же уровне, как и другие два передних винта. Убедитесь, что все три винта установлены достаточно высоко, чтобы избежать нарушения иглой АСМ при размещении tipholder в РП головы. Вставьте tipholder в РП головы и закрепите ее, затянув зажимной винт в задней части головы. После включения лазера, выравнивание лазерного пятна на консоли АСМ с помощью центрального (у) и правой (х) ручки лазерной коррекции на верхней части головы.Мониторинг отраженного лазерного луча на листке бумаги, чтобы позиционировать лазерное пятно именно в конце кантилевера АСМ. Отрегулируйте положение подвижного зеркала итеративно помощью ручки регулировки фотоприемник для достижения максимального сигнала (сигнал SUM), тем самым гарантируя, что отраженный лазерный луч в настоящее время получили ровно по четыре квадранта фотоприемника. Опустите кончик AFM стягиванием руководство винта спереди и моторизованных винт обратно настройка СЗМ сканер, визуально мониторинга подход иглой АСМ к поверхности образца с помощью инвертированного микроскопа. Убедитесь, что все три винта на том же уровне, чтобы избежать артефактов изображения наклонной образца. Возьмите наконечник к образцу, но не так близко, что кончик касается и прорывается через поверхность образца. На данный момент, лазерный луч отражается от кантилевера АСМ будет отскакивать от подвижного зеркала на фотодетектор. Для режима АСМ с кремниякон нитрида АСМ, установить выходной сигнал (вертикальное отклонение напряжения) до -2 В для 0 В уставки и сигнала DIFF (вертикальное / горизонтальное разницы) до 0 В, регулируя положение зеркала. Использование Наноскоп программного обеспечения, нажмите на значок микроскоп и выбрать подходящий профиль (контактный режим АСМ). Использование "Scan управления Настройки" панели, установить скорость сканирования и сканирования, например, размер, 10 микрон, размер сканируемого оригинала и 2 Гц частота сканирования. Позвольте иглой АСМ заниматься поверхности образца, нажав на участие наконечником значок. Управляя моторизованных задний винт базе СЗМ, программа теперь будет снизить наконечник, пока он занимается поверхности образца. Процесс сканирования будет автоматически запускаться один раз верхушка занимается успешно. Следить за процессом сканирования с использованием как образ и сферы режимы программного обеспечения, настройка параметров, таких как уставки, интегральной составляющей, пропорциональной выгоды, размер сканирования, скорость сканирования, линий и образцы / линия многократно для достижения высокихразрешение изображения. Начать сканирование с большой оси диапазон (по данным шкалы), а затем тщательно снизить стоимость данных масштабе наблюдать за лучший контраст поверхности особенностей на изображении. Свернуть появление белых областей на отсканированном изображении, которые показывают, что высота поверхности функции превышает имеющиеся оси диапазона. Запись изображения, чтобы сохранить файл данных, а затем обрабатывают данные с помощью функции сжатия для удаления артефактов изображения за счет вертикальной (Z) сканер дрейф, изображения луков, и вертикальное смещение между строк развертки, 9, наконец, вычислить среднюю шероховатость. После сохранения данных, убрать иглой АСМ, поменяв действие с компьютерным управлением винт двигателя, который был использован для его участия. Обработка изображения может осуществляться в автономном режиме анализа изображений и / или используя другой компьютер. Используйте перед серым ручки металлические наконечник держателя для изменения х и у позициям область сканирования, а затем повторить измерение в пять образцов LocaTIONS проверить воспроизводимость, заменив кантилевера АСМ, если качество изображения ухудшается. 6. Представитель Результаты Химический сдвиг анализ CPMAS 13 С-ЯМР (рис. 3) определены основные функциональные группы, присутствующие в исчерпывающе депарафинированных помидор кутикулы (кутина). Ключевым фрагментов углерода в кутина biopolyester оказались длинноцепочечных алифатических соединений (0-45 т), кислородом алифатические (45-110 частей на миллион), многократно связями и ароматических соединений (110-160 частей на миллион), и карбонилы (160-220 частей на миллион). Кислородом алкильных фрагментов (СНО + CH 2 O) играют ключевую роль в создании ковалентной связи между звеньев биополимера кутина, образуя молекулярную архитектуру матрицы кутина. Различия в относительной области пик наблюдается в спектральной области между промилле 45 до 100 показывают, что мутант кутина имеет относительно большую долю сшивки формирования СНО Structura л остатков по сравнению с диким типом кутина; осторожны количественных измерений с использованием прямого поляризации (DPMAS) ЯМР 5 методов поддержки этого вывода (данные не представлены). CPMAS 13 С-ЯМР показал также постепенно уменьшается воск пик на 31 страниц в минуту (рис. 4), что свидетельствует о последовательном удаление эпи-и intracuticular воск от кутина восковой композитный, сохраняя при этом основную архитектуру химической кутина биополимера. Параллельный анализ АСМ-изображения (рис. 5) показал, неровности поверхности за счет ступенчатого извлечения эпи-и intracuticular воск из плодов кутикулы, показывая изменения в организации кутикулярной сборки. На рис. 1 экстрактор Сокслета (изображение Источник: Википедия). "/> Рисунок 2.) Сканирующий зондовый микроскоп. Б) глава СПУ (взято из руководства АСМ обучения, предоставляемого цифровых инструментов). Рисунок 3. 150 МГц CPMAS 13 С спектров ЯМР исчерпывающе депарафинированных красный фрукт спелый помидор кутикулы (cutins) от дикого типа (M82) и мутантной (CM15) показывают резонансы химических сдвигов соответствующих функциональных групп сшитого hydroxyfatty кислоты на основе полиэстера, а также некоторые многократно связанных фрагментов. Все спектры были получены с 10 кГц частотой вращается. Рисунок 4. 150 МГц 13 CCPMAS спектров ЯМР коммерческие красный спелый помидор кутикулы фрукты демонстрируют изменения состава на последовательное устранение эпикутикулы и intracuticular воски гуммиарабика механической добычи и TWо минуты хлороформ падение, соответственно. Все спектры были получены с 15 кГц частотой вращается. Рисунок 5. АСМ изображения и шероховатости оценки частично депарафинированных коммерческих помидор смазывают показано на рис 4 после ступенчатого удаления эпикутикулы (слева) и intracuticular (справа) воска.