Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

1. Labeling und Fixierung von Zellen Add 1 ul Cell Proliferation Markierungsreagens (BrdU) pro ml Zellkulturmedium (1 bis 1000 Verdünnung) 1 Stunde vor der Ernte. Die Kennzeichnung Zeitraum eventuell auf langsamer wachsende Zellen verlängert werden. Zur Ernte Zellen absaugen Kulturmedium und gründlich mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie gründlich zu entfernen Spuren von Medium. Wash Kulturen schnell ein drittes Mal mit PBS, 3 mM EDTA und saugen gründlich. Fügen Sie ein kleines Volumen von PBS mit 3 mM EDTA zu jedem Gericht wird 0,5 ml für eine 6 cm Schale ideal. Inkubation bei 22 ° C für ca. 5 Minuten, um Zellen zu trennen. Transfer in ein 15 mL konischen Rohr. Centrifuge Zellen bei 500 xg für 5 Minuten auf Pellet, Überstand entfernen und gründlich resuspendieren in 100 ul PBS. Fix-Zellen durch Zugabe von 5 ml 95% EtOH, tropfenweise unter Vortexen. In diesem Schritt können die Zellen bei 4 ° C für mindestens ein aufbewahrt werdenim Monat. 2. Denaturierung und Färbung von BrdU und DNA Centrifuge Zellen bei 500 xg für 5 Minuten auf Pellet-Zellen und entfernen Sie 95% EtOH. Resuspendieren in 1 ml 2N HCl und 0,5% TX-100, indem in einem tropfenweise Mode unter Vortexen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Zentrifuge nach wie vor in Abschnitt 2.1 und sorgfältig absaugen Überstand da die Zellen eine sehr lockere Form von Pellets bei diesem Schritt. Vorsichtig in 1 ml 0,1 M NaB 4 O 7 (pH 8,5) resuspendieren und inkubiert für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Pellet-Zellen wie oben in Abschnitt 2.1 und resuspendieren in 0,5 ml Antikörper-Lösung (PBS mit 1% BSA und 0,2% Tween-20) mit Maus-Anti-BrdU Antikörper verdünnt 1 bis 50. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Pellet-Zellen wieder und resuspendieren in 50 ml Antikörper-Lösung mit Kaninchen-anti-Maus Sekundärantikörper konjugiert FITC verdünnt 1 bis 25. Inkubieren für 30 Minuten aufTisch-und vor Licht schützen. Centrifuge Zellen ein letztes Mal und resuspendieren in 0,5 ml Propidiumiodid und RNase-Lösung (PI-RNase-Lösung, PBS mit 1% BSA, 10 mg / mL Propidiumiodid, 0,25 mg / mL RNase A) und inkubieren im Dunkeln bei 37 ° C für 30 Minuten. Alternativ können RNA über Nacht bei 4 ° C verdaut werden in der Dunkelheit. Pass-Lösung durch eine Zelle Sieb, um Aggregate zu entfernen und sammeln einzelne Zellen in einem geeigneten Rohr für Probenaufnahme auf Ihrem Durchflusszytometer. Auch hier sollten Proben von direkter Lichteinwirkung geschützt werden. 3. Analyse mittels Durchflusszytometrie Die Zellen sind durch eine Standard-Durchflusszytometer, die in der Lage zu diskriminieren Dubletten (zwei Zellen, die durch die Messzelle als einem Durchgang) mit den entsprechenden Nachweis Fähigkeit zur Propidiumiodid und FITC wird analysiert werden. Einzelne Zellen können in diesem Durchflusszytometrie Anwendung durch Gating für Veranstaltungen auf Vorwärtsstreuung und side scatter Pop Basis erkanntulations und mit den Eigenschaften von DNA-Färbung mit Propidiumiodid. Das Erscheinungsbild einer Dublette diskriminierenden Dot-Plot schwankt zwischen Durchflusszytometern und stützt sich auf Propidiumiodidfärbung Eigenschaften finden Sie Ihren lokalen Durchflusszytometrie Anlage zur Beratung über die Einsetzung eines Dublett-Diskriminator in Ihrer Analyse. In der Regel in einer asynchron proliferierenden Population von Zellen, werden einzelne Zellen in der Regel die beiden am häufigsten vorkommenden Peaks (2N und 4N DNA) in das Wams diskriminierenden Handlung und ein Tor sollte um sie herum gezogen werden. Diese wählt einzelne Zelle Ereignisse, die für alle nachfolgenden Analysen sind unten. Die erste zu untersuchende Probe sollte ein asynchron proliferierenden Kultur, die als positive Kontrolle für die Färbung und Durchflusszytometer Set-up dient. Stellen Sie die Empfindlichkeit von Photomultipliern für Propidiumiodid-Färbung, so dass die 2N und 4N Spitzen von Singulett-Zellen bei 200 und 400 (willkürliche Einheiten) sind auf der X-Achse zentriert. Wir haben oft Flecken eine reiche sls dieser Zellen zu gewährleisten, dass alle Parameter des Durchflusszytometer wurden entsprechend ohne Verwendung von bis diese Probe eingestellt. Diese positive Kontrolle ist auch hilfreich für neue Benutzer besser kennen zu lernen mit dem Betrieb der Durchflusszytometer. Passen Sie die Empfindlichkeit des Photomultipliers für FITC-Erkennung, so dass G1 und G2 / M Populationen oben Hintergrund. BrdU-positiven Zellen soll rund 10 Mal heller und der Y-Achse sollte als einer logarithmischen Skala dargestellt werden. Manchmal ist es hilfreich, eine negative Kontrolle für BrdU-Färbung (durch Austausch der anti-BrdU Antikörper mit unspezifischen IgG in Schritt 2.3) klar zu unterscheiden positiv gefärbten Zellen enthalten. Passen Ausgleich zwischen Propidiumjodid und FITC, so dass einzelne Ereignisse, die vom Durchflusszytometer bilden eine hufeisenförmige Bogen von G1 in den unteren erfasst bis links nach S-Phase und nach unten in die untere rechte für G2 / M. Bitte beachten Sie folgenden Hinweis für eine mehr in die Tiefe disDiskussion der Grundsätze und Anwendung der Durchflusszytometrie und Referenzen gibt es in bestimmten Anwendungen 2. 4. Datenanalyse 5 000 bis 10 000 einzelne Zelle Veranstaltungen mit den gewünschten Bereich der DNA-Gehalt sollte für jede Probe gesammelt werden, um das Vertrauen, dass die Population von Zellen in der Kultur wurden gründlich abgetastet haben. Sobald Zellen für Propidiumjodid und BrdU Inhalte, die sie benötigen, um zum G1, S, oder G2 / M Phase zugeordnet werden gemessen worden. Tun Sie dies, indem Toren rund um die beiden BrdU negativen Populationen bei 200 und 400 (G1 und G2 / M bzw.) zentriert ist. Alles über diese Boxen in einem einzigen Tor, das S-Phase (Abb. 1A) Maßnahmen einbezogen werden. Der Prozentsatz an Zellen in jedes Tor stellt die relative Anzahl der Zellen in G1, S und G2 / M (Abb. 1B). 5. Alternate-Protokoll für die Analyse von Zell-Zyklus in einer gemischten Population von Zellen Diese alternative Protokollbesonders hilfreich, wenn die Transfektion von Expressionsvektoren routinemäßig führt zu einem geringen Prozentsatz der Zellen, die das Genprodukt von Interesse, oder wenn medikamentöse Behandlung zu einer reinen Population von Zellen auszuwählen unpraktisch ist. Dies führt zu einem relativ geringen Anteil der Zellen von Interesse, die mit einer großen Population von kontaminierten untransduced Zellen. In diesem Fall Co-Transfektion von Plasmiden Ausdruck Ihrer Gen oder shRNA von Interesse zusammen mit einem Plasmid, das ein Marker drückt zum Nachweis von transfizierten Zellen mittels Durchflusszytometrie, wie eine Membran verankert GFP 3, oder einer ausländischen Zelloberflächenmarker wie CD19 4 oder CD20 5. Für die Zwecke dieses Protokolls werden wir CD20 Färbung als Beispiel nehmen, aber Färbung für CD19 ist im Wesentlichen identisch. Im Falle der Transfektion mit CD20, gibt es keine Notwendigkeit, BrdU-Label einfach Ernte Zellen wie in den Schritten von 1,2 bis 1,5 beschrieben und durch Zugabe von 20 ul FITC-konjugierten anti-CD20-Antikörper gegen die Zellen auf i Fleckce für 20 Minuten im Dunkeln. Fix Zellen, wie in Schritt 1.6 beschrieben. Die Zellen können wieder für mindestens einen Monat bei 4 ° C gelagert werden in der Dunkelheit. Für die Detektion von GFP, lassen Sie den Antikörper-Färbung von diesem Schritt und fix und speichern Zellen, wie beschrieben. Re-Hydrat die Zellen durch Pelletierung in der Zentrifuge bei 500 xg für 5 Minuten und Resuspendieren in 5 ml PBS mit 1% BSA. Re-Pellet die Zellen bei 500 xg für 5 Minuten und die Zellen in 0,5 ml Propidiumiodid und RNase-Lösung wie oben in Abschnitt 2.5 beschrieben. Weiter zum Zellpräparation Anweisungen in 2,6 und Analyse Anweisungen in 3.1 und 3.2 folgen. Passen Sie die Empfindlichkeit des Photomultipliers für FITC-Erkennung, so dass ungefärbte Zellen oben Hintergrund. Im Idealfall wird CD20-FITC-positiven Zellen werden 10x bis 100x stärker gefärbt als Hintergrund und die Y-Achse dieses Grundstück sollte als eine logarithmische Skala (Abb. 2A) angezeigt werden. CD20-positive Zellen, die 10x heller als backg sindRunde (und mit Propidiumiodid-Färbung zwischen 200 und 400) sollten zur Anzeige in einem Propidiumiodid gegenüber Zellzahlen Histogramm gewählt werden, wie in Abb. gezeigt. 2C. Für Zelllinien, die Marker, die sich leicht gefärbt sind hell (dh 10x bis 100x höher als der Hintergrund) das CD20-positive cut-off bei 10X Hintergrund sollte sein, ausdrücken. Einbeziehung der schwächeren Färbung Zellen erhöht die Variabilität in diesen Experimenten, vermutlich, weil das Gen von Interesse ist auch schwach in diesen Zellen exprimiert werden. Für Zelllinien, die nur Rendite schwach gefärbten CD20-positive (dh weniger als 10x Hintergrund), Bestimmung von einem Cut-off sollte mit einem Negativ-Kontrolle, bestehend aus CD20 angefärbt, nicht transfizierte Zellen. Mindestens 1000 CD20 positive Ereignisse sollten für jede Probe gesammelt werden. Experimente mit weniger als 1000 Veranstaltungen produzieren hohe Variabilität. Software-Pakete wie ModFit LT (Verity Software), Multi-Zyklus AV (Phoenix Flow Systems) und Flow-Jo (Tree Star) verwenden mathematische Schätzungen derder G1, S und G2 / M Populationen, die an die Form der Kurve in Histogrammen, wie sie in Abb. beitragen. 2B und C. 6. Repräsentative Ergebnisse: Wir bieten Ihnen drei Beispiele für experimentelle Zellzyklus-Analysen unter Verwendung unserer Ansätze. Die erste nutzt retrovirale Expression von Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor p27KIP1 in embryonalen Maus-Fibroblasten. Vierundzwanzig Stunden nach Medikament Auswahl für die Virusinfektion vollständig war, wurden die Zellen mit BrdU Puls für 1 Stunde beschriftet. In diesem Experiment ektopische Expression des Inhibitors wird verwendet, um die Vermehrung der Zellen (Abb. 3A und B) zu verhaften. Wie in Abb.. 3B wenig BrdU positive Ereignisse werden in der S-Phase-Gate offensichtlich in Reaktion auf p27. Ebenso ist der Anteil der Zellen in S-Phase für p27 exprimierenden Zellen sehr gering, wie in Abb. diagramed. 3C. Diese Art der Analyse ist sehr wirksam bei der Charakterisierung der Zellzyklus-Kontrolle Mängel in Zellen, die aus verschiedenen Stämmen abgeleitet gEn gezielte Mäusen 6, 7, 8. Im zweiten Experiment wurden transformierten Brustepithelzellen (MCF10A) mit dem Wachstum hemmende Zytokin behandelt, transforming growth factor beta eins (TGF-β1) für 24 Stunden. Die Zellen wurden mit BrdU für vier Stunden beschriftet unmittelbar vor der Ernte. Wie in Abb.. 4 BrdU-Markierung in der S-Phase-Zellen stark von TGF-β1 Signalisierung verringert, ist die Spezifität unseres Färbung auch mit einem IgG Negativkontrolle (Abb. 4C) validiert. Die Quantifizierung der verschiedenen Phasen des Zellzyklus bestätigt, dass TGF-β1 in erster Linie hemmt die Proliferation in der G1-Phase des Zellzyklus, was zu einer Akkumulation in dieser Phase. In unserem letzten Beispiel sind pRB mangelhaft SaOS-2-Zellen mit einer CMV-CD20-Expressionsvektor und entweder CMV-RB oder CMV-β-Gal als Kontrolle transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und gefärbt, und fixiert. Die Durchflusszytometrie Analyse dieser Zelles ist in Abb. dargestellt. 5. Dies zeigt die Zellzyklus-Verteilung der Negativ-Kontrolle transfizierten Zellen (Abb. 5A) im Vergleich mit der Verteilung nach 72 Stunden pRB Ausdruck (Abb. 5B). Nach Kurvenanpassung durch Multi Cycle-Software, ist ein direkter Vergleich der Anteil der Zellzyklus-Phasen in Abb. gezeigt. 5C. Dies zeigt die Anhäufung von Zellen in G1 folgenden pRB Ausdruck und die relative Verarmung der Zellen aus der S-und G2 / M Phase. Wir haben Variationen über dieses Tests verwendet werden, um G1-Arrest Mechanismen weitgehend 9, 10, 11, 12, 13 Sonde. Diese Beispiele zeigen, wie die Kontrolle des Zellzyklus in Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen oder Zelle Manipulationen gemessen werden kann. Dieser Ansatz kann daher für viele Anwendungen, die die Messung des Zellzyklus Position in der Kultur geben Experimente erfordern angepasst werden. Abbildung 1. QuantitATION der Zellzyklusphasen durch kombinierte Propidiumiodid und BrdU-Färbung (PI-BrdU). (A) Das Panel zeigt dreidimensionale Durchflusszytometrie von Propidiumiodid und BrdU gefärbten Zellen. Beachten Sie, dass Zellen mit 2N und 4N DNA-Gehalt über die 200 und 400 Mark auf der X-Achse Skala für Propidiumiodidfärbung Intensität zentriert sind. BrdU Färbeintensität ist auf einer logarithmischen Skala auf der Y-Achse gemessen. Beachten Sie die Position von Toren verwendet, um Zellen in der G1, S und G2 / M Phase des Zellzyklus zu quantifizieren. (B) Der relative Anteil der Zellen in jeder der G1, S und G2 / M Toren von A sind in dieser Grafik dargestellt. Abbildung 2. Quantifizierung der Zellzyklusphasen in ausgewählten Zellen mit Propidiumiodid und die Zelloberflächenmarker CD20. (A) Dieses Panel Propidiumiodid und CD20-Färbung für eine Mischung von Zellen zeigt, von denen einige ektopisch CD20 exprimieren und pRB. Beachten Sie, dass die Zellen mit2N und 4N DNA (das am häufigsten vorkommende Populationen) sind über die 200 und 400 Mark auf der X-Achse zentriert. Die Position der CD20 + Tor wählt Zellen, angefärbt mindestens 10x heller als Hintergrund. (B) Eine graphische Darstellung der Zellzahlen im Vergleich zu Propidiumiodid-Färbung für CD20-negativen Zellen in Panel A, die asynchron proliferierenden gezeigt. (C) Eine ähnliche Grafik ist für CD20-positiven Zellen von der Platte gezeigt, dass A induziert worden sein, um mit pRB Ausdruck Verhaftung und enthalten Zellen mit allem 2N DNA-Gehalt. Dies zeigt, dass eine festgenommene Subpopulation von anderen Zellen in dieser Kultur mit dieser Maltechnik unterschieden werden können. Abbildung 3. Hemmung der Zellproliferation durch p27KIP1. (A) PI-BrdU Analyse wird verwendet, um die Zellzyklusphasen in einer asynchron proliferierenden Population von Zellen, die mit einem leeren pBABE retroviralen vecto transduziert wurden gemessenr. (B) Eine ähnliche Analyse von Zellen transduziert mit pBABE-p27. Beachten Sie das Fehlen von Zellen in der S-Phase und eine größere Intensität der Ereignisse in G1 und G2 / M Tore. (C) Quantifizierung von Zellen in den jeweiligen Phasen des Zellzyklus in asynchron proliferierenden Steuerung und p27 exprimierenden Zellen. Abbildung 4. Hemmung der Zellproliferation durch TGF-β1 (A) PI-BrdU Analyse von asynchron proliferierenden MCF10A Zellen. (B) Analyse der Zellen mit 100 pM TGF-β1 für 24 Stunden behandelt. Beachten Sie die Ansammlung von Zellen in erster Linie in der G1-Phase des Zellzyklus. (C) Validierung von BrdU Färbung durch den Austausch des anti-BrdU Primär-Antikörper mit einem nicht-spezifischen IgG-Kontrolle in asynchron proliferierenden Zellen. (D) Graphische Quantifizierung der jeweiligen Zellzyklusphasen von A und B. <br/> Abbildung 5. Hemmung der Zellproliferation durch pRB. (A) Die Zellzahlen im Vergleich zu Propidiumiodid-Färbung von CD20 und ß-gal transfizierten Zellen gezeigt. Dies ist eine wichtige Kontrolle der Transfektion teilweise synchronisieren können Zellen, wodurch die transfizierten Population (CD20 – Zellen) als eine unangemessene Kontrolle der transfizierten Subpopulation. Die transfizierten Zellen müssen mit anderen analog transfizierten Zellen verglichen werden. (B) Die Zellzahlen im Vergleich zu Propidiumiodid Graphen von CD20 und pRB-Zellen transfiziert. Beachten Sie die fast ausschließliche Präsenz einer 2N Höhepunkt. (C) Grafische Darstellung des Zellzyklus Phase Proportionen von A und B mit Kurvenanpassung Methoden in Multi Cycle-Software bestimmt.