Annotatie van Plant functie van een gen via gecombineerde Genomics, metabolomics en Informatica

1. Monstervoorbereiding Plantaardige materialen worden geoogst en direct ingevroren. Ingevroren plantaardige materialen gemalen door mixer molen (of mortel) en opgeslagen in Falcon buis of eppendorfbuisje bij -80 ° C. 2. Extraction voor de metaboliet Profiling Aliquot bevroren plantmateriaal in een 2 ml Eppendorf buis. Voeg 5 pi extractiebuffer milligram versgewicht bevroren plantmateriaal. Voeg een metaal (of gilconia) kogel en gehomogeniseerd bevroren poeder met de mixer Mill 2 min bij 25 ls -1. Centrifugeer 10 minuten bij 12.000 rpm. Breng de bovenstaande aan centrifugaalfilter NANOSEP. Centrifugeer 2 min bij 4.000 tpm. Breng de bovenstaande nieuwe Eppendorf buis en bewaren bij -20 ° C tot gebruik. 3. Metaboliet Profilering van LC-MS Stel HPLC en controleer de temperatuur van kolom oven en monsterhouder. Stel MS conditie en controleer de staat van vacuüm-en verwarmings-capillair. Voer m / z kalibratie van MS detector. Overdracht van 50 pi van extracten glazen flesje voor LC-MS. Injecteer 5 ul van extracten naar LC-MS. 4. Data-analyse Configureren Xcalibur of Metalign 4 en selecteer de data-analyse te verwerken. Maak een tabel van de gedetecteerde pieken van uw interesse in overeenstemming met de klasse verbindingen in tabel I. Identificeer pieken door co-elutie van standaard verbindingen. Aantekeningen voorzien gedetecteerd pieken met behulp van MS 2 analyse, literatuuronderzoek, metaboliet database (figuur 2, 12,13). 5. Voorspelling van metabolische route Construct een mogelijke ingang met gedetecteerde verbindingen. Voorspelling van pad met piek aantekeningen moet worden gebaseerd op de chemische structuur van de gedetecteerde verbindingens door het voorspellen van het koppelen van enzymatische functies op de metabole route 13. Het structureren van biosynthetische stappen moeten worden uitgevoerd met nauwkeurige piek annotatie. Maar bepalen gedetailleerde chemische structuur, bijvoorbeeld glycaangedeelte is niet noodzakelijk deze stap, door voorspelling van suiker gedeelte en adductiestand zeer moeilijk te identificeren door MS-analyse. Bepaling van het soort suiker, zoals hexoside en pentoside zullen geïdentificeerd worden door enzymatische assay van suiker donor bij de laatste stap van het project. Meestal bouw van de voorspelling van de weg dient te worden uitgevoerd als kleine molecule is intermediair van grotere moleculen, behalve in de enkele gevallen, zoals uitdroging reactie. Lijst van atomaire molecuulgewicht, bijvoorbeeld 16 m / z tussen-H en-OH groep (oxidatie) 14 m / z (koolstofatoom) voor verschil-OH en-OMe (methylering) en 162 m / z ( MW-H 2 O) voor hexose (glycosylering), is nuttig voor het voorspellen. Bepaling vanwijziging type met correlatie analyse van weefsels specifieke helpt voorspelling van de metabole route. Database van de algemene metabole route, zoals KEGG database ( http://www.genome.jp/kegg/ ) en PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ), is zeer effectief voor het voorspellen van metabole route van uw interesse. 6. Voorbereiding van Gene Lijst met Arabidopsis orthologe Gene ID Download gen ID-lijst van genomische database. Voeg Arabidopsis gen ID van orthologe gen, in het geval van uw doelgroep plant is niet Arabidopsis. Maak een lijst van genen in je pad-of-interest. Annotatie van Arabidopsis pad gegevens en gen-familie gegevens beschikbaar zijn in TAir website ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). Als u een lijst opgesteld van Arabidopsis orthologe genen, kunt u vervolgens combine ze. 7. Co-uitgedrukt Gene Analysis Test het bereide gen ID-lijst om de beste database voor je pad zoeken op het controleren van de correlatie met behulp van bekende gen-paren in je pad-of-interest (Tabel II). Als co-expressie database of genexpressie-database zijn niet beschikbaar in de plant van uw interesse, moet Arabidopsis co-expressie-database worden gebruikt met een lijst van Arabidopsis orthologe genen. Bij gerst, rijst kan, populier, tarwe, soja Medicago en co-expressie analyse van plantensoorten worden (Tabel II). Bouw het kader voor uw doelgroep co-expressie netwerk op basis van de aansluitingen van de bekende genen in je pad-of-interest. Voeg gecorreleerde kandidaat-genen (r <0,4 ~ 0,90, binnen de geschatte waarde van de coëfficiënt waarde tussen de aansluitingen van de bekende genen in je pad-of-interest) en controleren hun gen-annotatie in uw predicted families om de aansluitingen van dit netwerk voor het vinden van de beste kandidaat-genen (figuur 3). Drempel van de coëfficiënt de waarde moeten worden gecoördineerd op basis van netwerkstructuur en de dichtheid van gecorreleerde genen. Maak lijst van genen die je in staat bent om in te perken als gespecialiseerde om uw doelgroep pad. Controleer genexpressie van het orgel specifieke kenmerken en stress responsen van uw kandidaat-genen. 8. Integratie van alle informatie naar New Pathways Voorspel Voeg goed gekarakteriseerde genen die zijn voor de zoekopdracht van de co-expressie-analyse gebruikt om de voorspelde metabole route. Controleer ongekarakteriseerde delen in deze route, bijvoorbeeld ongekarakteriseerde enzymatische stappen, transport eiwitten en transcriptiefactoren. Voorspel het meest geschikt gen annotatie voor deze ontbrekende ongekarakteriseerde stappen. Combineer de resultaten van de metaboliet profilering en kandidaat-genen van in silico gene expressie gebaseerd op de voorspelde route. Regel uw kandidaat-genen op het voorspelde pad op basis van gen-functie, bijvoorbeeld, acetyltransferase voor geacetyleerde metaboliet, glycosyltransferase voor glycoside, P450 voor geoxideerd verbinding. Fylogenetische bomen analyse van aminozuursequenties is bruikbaar voor enkele brede genfamilie zoals P450 en glycosyltransferase. Controleer de consistentie van weefsel specifieke kenmerken of stress responsen tussen metaboliet accumulatie en gen-expressie niveau van de kandidaat-genen. Controleer de verbindingen met andere stofwisseling voor het leveren van substraat en stress responsieve genen. 9. Experimenten voor Gene Identificatie Met behulp van Bio-middelen Controleer de beschikbaarheid van Bioresources biedt om te experimenteren voor de kandidaat-gen identificatie. Voer een experiment voor de identificatie van gen-functie met behulp van biologische rijkdommen, zoals KO mutant bibliotheek en volledige lengte cDNA bibliotheek. Thij experimenten voor functionele identificatie van genen met de voorbereiding van overexpressie planten en knock-out mutanten, enzymatische assay en promotor bindingstest, moeten worden uitgevoerd voor de beste kandidaat genen in je voorspelling. Recombinant eiwit assay voor de karakterisering van eiwit eigenschappen en bereiding van overexpressie planten beter worden uitgevoerd na bevestiging van metabolietenprofiel met KO mutant door het in aanzienlijk langer recombinant eiwit en gen klonen voorbereiden transformatie. 10. Representatieve resultaten De procedure van de geïntegreerde analyse beschreven in dit protocol heeft vele mogelijkheden, afhankelijk van specifieke experimentele doel en de keuze van biologische en analytische combinaties. Keuze van de procedures en de experimentele opzet moet worden goed uitgevoerd, op basis van uw doelgroep pad, verbindingen en plantensoorten. De integratie strategie beschreven in dit protocol is foc gebruikt op annotatie van plantaardige gen functie en de ontdekking van nieuwe genen functies met een efficiënt gebruik van verschillende bio-en data-bron. Verwachte resultaat is beloofd te voorzien van de enige geval van sluitende voorspelling. Dit feit geeft aan dat als er genoeg bewijzen kunnen niet worden gegeven door combinatie profielen, experiment niet worden gestart. Daarom in alle gevallen kunnen extra voorafgaandelijke zoals gerichte genexpressie door RT-PCR, ondersteunen de voorspelling van genfunctie. Nauwkeurigheid en juistheid van de voorspelling correleert hoger, afhankelijk van kwalitatieve verschil en het aantal van de variatie van combinatie. Daarnaast kunnen goede kandidaten en geldige resultaten alleen afkomstig zijn van nauwkeurige voorspelling van routes. Peak annotatie moet worden uitgevoerd door een combinatie van verschillende manieren, bijvoorbeeld literatuuronderzoek, referentie plantenextract, MS n analyse, orgel specificiteit en mutant analyse 13. 1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/> Figuur 1. Overzicht van de experimentele stroom van gen-annotatie via gecombineerde aanpak. In sommige gevallen, projecten te beginnen met de ontdekking van een nieuwe piek die wordt gedetecteerd in bijzondere voorwaarden of weefsels, en de wens om haar rol te begrijpen binnen het metabolisme. In andere gevallen het doel van het project is genidentificatie of ontdekking van belangrijke regulerende factoren, zoals de transcriptiefactoren. Ontwerp van experiment worden geschaafd een gegevensverzameling die duidelijk verschillen van metabolietniveaus in het doelgebied pad met een breed scala van weefselmonsters van verschillende organen toont, en differentieel gekweekte planten of planten die aan stress, en het onderwerpen van het materiaal metaboliet profilering. Mutanten en transgene planten en QTL onderdak fokmateriaal vertegenwoordigen ook geschikt genetisch materiaal voor deze studies. Voorspelling van nieuwe pad moeten zorgvuldig worden uitgevoerd met nauwkeurigepiek annotatie en combinatie aanpak met verschillende soorten metabolotype zoals orgel effecten en stress responsen op basis van genexpressie gegevens van uw pad-of-interest. In de laatste stap moet metaboliet en transcript profilering uitgevoerd worden die uiteindelijk, in combinatie met in silico analyse van web-middelen en de in vitro karakterisatie van genexpressie via heterologe expressie, leiden tot de bevestiging van het gen kandidaat en opheldering van de functie en positie binnen een metabole route. Afkortingen: QTL, kwantitatieve Trait Loci. Figuur 2. Werk stroom van combinatievormen aanpak voor piek annotatie. Een procedure voor piek identificatie en annotatie door de standaard verbinding, vergelijking van de wild-type en knock-out mutanten, multi-dimensionale massaspectrometrie van de doel-piek verwijst naar de massa spectra van de zuivere compond uit de databases 12. Afkortingen: DB, database, KO, knock-out, 1-D, een-dimensionale, 2-D, twee-dimensionale, NMR, nucleaire magnetische resonantie, IR, infra-rood; MS n, massa-massa spectrometries. Figuur 3. Voorbeeld co-regulering netwerk analyse van de anthocyaan pad. Coëxpressie analyses werden uitgevoerd met behulp van de PRIME ( http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ) gebaseerd op de dataset van ATTEDII versie 3 8,2 met de Pajek programma ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). Positieve correlaties (r <0,5) worden gebruikt om netwerk verbindingen te maken. Rode knoop: twaalf anthocyaan enzymatische genen (At5g13930, CHS, TT4, chalconsynthase, At3g55120, CHI, TT5, chalcon isomeriseren, At3g51240, F3H, TT6, flavanon 3-hydroxylase, At5g07990, F3'H, TT7, flavonoïde 3'-hydroxylase, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoïde 3 – O-glucosyltransferase, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol reductase, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidine synthese; At4g14090, A5GT, anthocyaan 5 – O-glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 "XT, vermeende anthocyaan 3 – O-glucoside 2" – O – xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, anthocyaan 5 – O-glucoside 6'' '- O-malonyltransferase, At1g03940, A3GCouT, anthocyaan 3 – O-glucoside 6 "- O – p-coumaroyltransferase) en twee transcriptiefactoren voor anthocyaan productie (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) werd gebruikt voor het zoeken van kandidaat-genen kandidaat-genen werden gevonden door een "kruispunt van de sets" zoeken met een drempelwaarde met een coëfficiënt van r <./ Em >> 0,50 bevraagd door de kruising van de sets door bevraagd alle genen (Veertien anthocyaan biosynthetische genen). Een co-expressie-netwerk, inclusief gecorreleerde kandidaat-genen (68 genen) en bevraagd genen (14 genen), werd opnieuw gebouwd door een "interconnectie van sets" zoeken met r> 0.50 met behulp van de PRIME-database. De output bestanden die zijn geformatteerd met bestand een. 'Net' van de Eerste database en netwerken werden getekend met behulp van Pajek software. Blauwe knooppunt geeft aan kandidaat-genen die correleren met anthocyaan genen. soorten Belangrijke secundaire metaboliet Arabidopsis thaliana Glucosinolaat, flavonol, anthocyaan, sinapoyl afgeleide Populus trichocarpa Flavonol, anthocyaan, salicylaat afgeleide Vitis vinifera Flavonol, anthocyaan, tannine, stilbeen Solanum lycopersicum Flavonol, anthocyaan, glycoalkaloid, chrologenate verwante, Nicotiana tabacum Flavonol, anthocyaan, nicotianamide, chrologenate verwante, acylsugar Oryza sativa Glycoflavone, anthocyaan, sterol derivaten Zea kan Glycoflavone, anthocyaan, benzoxazinone, sterol derivaten Medicago truncatula Isoflavonen, anthocyaan, saponine, Lotus japonica Isoflavonen, flavonol, anthocyaan, saponine, Tabel I. De belangrijkste secundaire metabolieten in model plantensoorten. Co-expressie-database Adres Plant kruis specs COP http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V PlaNet http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/ Plantensoorten ATEED-II http://atted.jp/ BAR http://142.150.214.117/welcome.htm COP http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop GeneCAT http://genecat.mpg.de/ Arabidopsis ACT http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser AthCoR@CSB.DB http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html CressExpress http://cressexpress.org/~~V PRIMe http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index Oryza sativa RiceArrayNet http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V Rice Array Database http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml Tabel II. Beschikbaar genexpressie-database voor het in silico co-expressie analyse.