联合基因组学，代谢组学和信息通过植物基因功能的注解

1。样品制备植物材料的收获，并立即冻结。 冷冻材料厂搅拌机磨制成粉末（或砂浆）和猎鹰管或Eppendorf管中于-80°C。 2。提取代谢物谱植物材料，在2毫升的Eppendorf管分装冷冻。 添加5μL提取每毫克冷冻厂材料的鲜重的缓冲区。 新增一个金属（或gilconia）的球，并融汇冻粉与调音台轧机在25 LS -1 2分钟。 在12000转离心10分钟。 转移上清NANOSEP离心式过滤器。 在4000转速离心2分钟。 将上清转移至新的Eppendorf管中，并储存在-20°C，直到使用。 3。代谢物谱的LC-MS 建立高效液相色谱法和检查柱箱温度和样品盘。 成立MS条件和检查真空和加热毛细管的状态。 执行的m / z MS检测校准。 50μL提取物转移到玻璃小瓶的LC-MS。 注入5μL提取物的LC-MS。 4。数据分析配置神剑传奇或Metalign 4，选择要处理的数据进行分析。 准备检测到您的利益峰表，按照表I类化合物。 识别标准化合物的共流出峰。 注释使用MS 分析 ，文献调查，代谢物数据库搜索（ 图2），12,13检测峰。 5。代谢途径的预测构建与检测的化合物可能的途径。预测使用高峰注解的途径，应根据检测到的化合物的化学结构S的 ​​预测连接酶的功能，代谢途径13。构建合成步骤应进行精确的峰值注释。但详细的化学结构的测定，例如糖基，是不可缺少的这一步，因为糖基和内收位置的预测是非常困难的，以确定由MS分析。酶法测定糖捐助的测定糖如hexoside和pentoside的类型将确定，在项目的最后一步。主要建设途径的预测，应为小分子较大分子的中间，除了在某些情况下，如脱水反应。原子分子量的名单，例如16米/ Z – H之间的差异和OH基（氧化），14米/ Z（碳原子）之间的-OH和-OMe的（甲基）差价和162 m / z为 （兆瓦H 2 O的己糖（糖基化）），是有用的预测。测定修改相关组织的具体分析的类型，有助于代谢途径的预测。一般代谢途径，如KEGG数据库（数据库http://www.genome.jp/kegg/ ）PlantCyc（ http://plantcyc.org/~~V ），为您感兴趣的代谢途径的预测是非常有效的。 6。基因名单的制备与拟南芥同源基因ID 下载从基因组数据库，基因ID列表。 添加同源基因的拟南芥基因ID，在你的目标工厂的情况下是不拟南芥。 准备一个利益的途径中的基因名单。在TAIR网页（ http://www.arabidopsis.org/~~V ），拟南芥的通路数据和基因家族的数据诠释。如果你准备拟南芥同源基因的清单，你可以随后组合NE他们。 7。共表达基因分析测试使用搜索最佳通路的数据库，使用众所周知的基因对您的利益途径（ 表二 ）检查相关的准备基因ID列表。如果数据库或共同表达的基因表达数据库是不是你的兴趣在植物，植物共表达数据库，应使用与拟南芥的同源基因的清单。在大麦的情况下，可用于水稻，杨树，小麦，苜蓿，大豆，植物物种的共同表达分析（ 见表二 ）。 基于利益的途径著名的基因连接，构建框架为目标的共同表达网络。 新增相关的候选基因（R <0.4〜0.90系数的途径利益知名的基因之间的连接价值的近似值，内），并检查他们在你的PR基因注释edicted家庭网络连接，寻找最佳的候选基因（ 图3）。系数阈值应根据网络结构和密度相关基因的协调。 使您可以作为专门为你的目标的途径缩小的基因列表。 检查你的候选基因的器官特异性和应激反应的基因表达。 8。的所有信息整合到预测的新途径新增查询共表达分析已用于预测代谢途径的基因特征。 检查这个途径在未知的部分，未知酶的步骤，例如运输蛋白和转录因子。 预测这些失踪未知的步骤最合适的基因注释。 结合GE 在硅片的代谢产物分析和候选基因的结果NE表达的基础上预测的途径。 安排您的候选基因，根据基因功能的预测途径，例如，乙酰转移酶的代谢产物乙酰化，糖基苷，P450的氧化复合。氨基酸序列的系统发育树分析是有用的宽一些，例如P450和糖基转移酶的基因家族。 检查的组织特异性应激反应或代谢产物的积累和候选基因的基因表达水平之间的一致性。 检查提供基板和应激反应的基因连接到其他代谢。 9。实验中使用的生物资源的基因鉴定检查的生物资源提供便利为候选基因鉴定实验。 执行实验利用生物资源，如高突变体库和全长cDNA文库，基因功能鉴定。 ţ他的实验与编制过度植物及敲除突变体，酶的检测和启动子结合试验，基因功能鉴定，必须在你的预测最好的候选基因进行。蛋白质性质的表征和过度植物准备好要进行确认后代谢产物的文件，使用正突变体，因为它需要相当长的时间准备改造重组蛋白和基因的克隆，重组蛋白检测。 10。代表结果在本协议中所述的综合分析的过程有很多可能性，取决于指定的实验目的和选择生物和分析组合。程序和实验设计的选择，应进行正确目标的途径，化合物和植物物种的基础上。在本协议中所述的一体化战略是FOC用于植物基因功能和新基因功能的发现与一些生物和数据资源的有效使用注释。预期的结果是承诺提供与确凿预测的唯一情况。这一事实表明，如果有足够的证据不能组合型材，实验不应该被启动。出于这个原因，在任何情况下，可以支持额外的初步实验，RT-PCR技术，如针对性的基因表达谱，基因功能的预测。预测的准确性和正确性的相关性更高的质的区别和数量组合的变化而定。此外，良好的候选人和有效的结果，只能来自准确预测的途径。高峰应进行注释的几种方法的组合，例如文献调查，参考植物提取物，MS n分析，器官特异性和突变分析13。 1“SRC =”/ files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg“/> 图1。实验相结合的方法，通过基因注释流程的概述。在某些情况下，项目开始发现这是在特殊条件下或组织发现一个新的高峰，和渴望了解在其新陈代谢作用。在其他情况下，该项目的目的是关键调控因子，如转录因子的基因鉴定或发现。实验设计应刨用一组数据显示了明显的差异，在你的目标途径的代谢水平，从不同器官的组织样本的广泛使用，接触应力条件差异生长的植物或植物，并受到材料代谢产物分析。突变和转基因植物以及QTL窝藏育种材料，也代表了适合这些研究的遗传材料。应认真进行准确预测新途径如metabolotype机关根据证券及应激反应的基因表达数据的途径利益的不同类型的峰值注释和相结合的办法。在最后一步，代谢物和成绩单分析应执行最终，当网络资源，在硅片分析和基因表达的特征， 通过异源表达在体外结合，导致确认的候选基因，并阐明其功能内的代谢途径中的地位。缩写：QTL定位，QTL定位。 图2。工作流高峰注释的组合方式。标准化合物的峰识别和注释，比较野生型和敲除突变体的过程，多维目标峰的质谱质谱纯COM从数据库12磅。缩写：DB，数据库;敲，敲了一维，一维，二维，二维核磁共振，核磁共振，红外光谱，红外多级质谱 ，质量质量spectrometries。 图3。例如合作的花青素途径调控网络分析的共表达分析进行了使用与总理（ http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ）设置ATTEDII版本的数据3 8,2的pajek计划（ http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ）。呈正相关（R <0.5）被用来进行网络连接。红色节点：12花色苷酶基因（At5g13930，社区卫生服务，TT4，查尔酮合酶; At3g55120，C您好，TT5，查耳酮isomerise; At3g51240，F3H，TT6，黄烷酮3 -羟化酶; At5g07990，甘蓝型油菜F3'H，TT7，类黄酮3'-羟化酶; At5g17050，Fd3GT，UGT78D2，类黄酮3 – O型葡萄糖; At5g17220，AtGSTF12，TT19 ; At5g42800，DFR的二氢叶酸还原酶，TT3 At4g22880时，ANS / LDOX，TT18，花青素的合成; At4g14090 A5GT，花青素5 – O型葡萄糖; At5g54060，A3G2“XT的，公认的花青素3 – O-葡萄糖苷2” – O – xylosyltransferase; At3g29590，A5GMaT，花青素5 – O-葡萄糖苷6''' – O型 malonyltransferase; At1g03940，A3GCouT，花青素3 – O-葡萄糖苷6“ – O – P-coumaroyltransferase）和两个花青素生产的转录因子（At1g56650， PAP1; At1g66390，PAP2）用于寻找候选基因的候选基因被发现一个“集合的交集”搜索与阈值的系数 r <。/ EM >>质疑0.50套所有质疑的基因（十四花青素合成基因）的交点。共同表达网络，包括相关的候选基因（68个基因）和查询基因（14个基因），是由一个“套联网”重新构建与R> 0.50总理数据库搜索。与“网”从总理的数据库和网络的文件格式的输出文件使用Pajek软件绘制。蓝色节点代表候选人花青素基因相关的基因。 种类 主要次生代谢产物 拟南芥 硫代葡萄糖甙，黄酮，花青素，sinapoyl的衍生 杨毛果 黄酮，花青素，水杨酸衍生物 葡萄 黄酮，花青素，单宁酸，苯乙烯 马铃薯lycopersicum 黄酮，花青素，glycoalkaloid，chrologenate相关， 烟草 黄酮，花青素，nicotianamide，chrologenate相关acylsugar 水稻 glycoflavone，花色苷，甾醇衍生物 玉米5月 glycoflavone，花青素，benzoxazinone，甾醇衍生物 苜蓿 花青素，异黄酮，皂甙， 莲花粳稻 大豆异黄酮，花青素，黄酮，皂甙， 表一，主要模式植物的次生代谢产物。 共表达数据库 地址 植物交叉规范IES 缔约方会议 http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V 沛 http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/ 植物物种 ATEED-II http://atted.jp/ 英美 http://142.150.214.117/welcome.htm 缔约方会议 http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop GeneCAT http://genecat.mpg.de/ 拟南芥 法 http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser AthCoR@CSB.DB http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html CressExpress http://cressexpress.org/~~V PRIME http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index 水稻 RiceArrayNet http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V 水稻阵列数据库 http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml 表二。可用硅片共同表达分析基因表达的数据库。