γHV68感染小鼠的测量
Summary
γ-疱疹病毒（γ- HVS）在其主机建立终身续保。感染小鼠γ- HV68提供了一种基因听话<em>在体内</em>模型为表征的生命周期/γHVs发病机制。这个协议描述γHV68感染的检测和定量菌斑形成，传染病中心，qPCR实验感染后的急性和潜伏阶段。
Abstract
γ-疱疹病毒（γ- HVS）为显着的能力，建立潜伏感染的淋巴细胞1。人类γ- HVS，如EBV和KSHV的宿主范围狭窄，严重阻碍了详细的致病性研究。小鼠γ-疱疹病毒68（γHV68）股广泛的遗传和生物与人类的γ- HVS， 相似之处是2 murid啮齿动物的天然病原体。因此，γHV68感染小鼠近交系的评价，在病毒感染的不同阶段提供了一个认识过程中γ- HVS感染病毒的生命周期和发病机制的重要模式。
鼻内接种后，γHV68肺感染的急性血症结果，就是后来成隐性感染者脾细胞及其他细胞，这可能是整个生活的主机3,4恢复解决。在这个协议中，我们将描述如何使用斑块的检测，以评估在传染性病毒滴度肺组织匀浆后滴鼻感染（DPI）在早期阶段（5 – 7天）在Vero细胞单层。虽然急性感染主要是清除2 – 3周，隐性感染的γHV68各地建立了14 DPI，以后维持在小鼠的脾。隐性感染者通常会影响在受感染的组织细胞的一个非常小的人口，据此病毒保持休眠状态，并关闭其大部分基因的表达。潜伏感染的脾细胞自发激活后病毒组织培养，可以通过扼要传染病中心（IC）检测，以确定病毒潜伏负荷explanting。要进一步病毒基因组副本的数量估计在急性和/或潜伏感染的组织，实时定量PCR（定量PCR）用于其最大的灵敏度和准确性。的qPCR和斑块的检测和/或IC检测的结果结合起来分析，就会发现病毒的时空分布在体内的复制和传染性。
Protocol
Discussion
γHV68已被广泛用于作为一种模式来理解人类γ- HVS 2,4,5的发病机制。在这个协议中，我们描述了三个经常使用的方法，包括斑块传染性病毒滴度的检测，IC病毒潜伏负载检测，病毒基因组负载的qPCR，以评估后，在小鼠滴鼻接种γHV68急性和隐性感染者。
斑块的检测已广泛使用，以确定受感染的细胞或组织中的病毒滴度，但不同的病毒正在使用的最佳条件。这主要是因为?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢任孙（美国加州大学洛杉矶分校）和Seungmin黄某（华盛顿大学）的技术咨询和支持。这项工作是由巴克斯特基金会，国家卫生赠款研究院（R01 CA140964和R21 AI083841 C.梁）。
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
Referenzen
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