Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

1. Подготовка животных для работы с изображениями Примечание: Мы используем взрослый C57BL мышей. Различные трансгенных линий могут быть использованы в зависимости от исследования вопроса. Микрососудистой хирургии и пульсоксиметрии облегчается у мышей с белым мехом (например, FVB деформации). Подготовьте место операции на скамейке. Все хирургические инструменты должны быть в автоклаве или дезинфекция с 70% этанола. Вставьте ректального датчика, и постоянно измерять температуру тела животного на протяжении всей процедуры Анестезию мыши, используя первоначально 5% ИФ. В 15-30 х годов, когда животное не двигается, положите его на грелку (37 ° C), и примените маску для непрерывной доставки воздуха, содержащего 1,3-1,5% ИФ). Убедитесь в том, что животное не реагирует на болевой раздражитель (например, хвост щепотку). Использование искусственной слезы гель для покрытия глаза мыши, с целью предотвращения воздействия сухого воздуха. Использование электрической бритвой, удалить волосы FПЗУ головы и обеих бедер. Применяют для удаления волос (например, Nair) на бедре в течение 2 минут, а затем протрите ее тщательно, чтобы удалить оставшиеся волосы. Это бедра будут использованы для оксиметрии. Лечить головы с использованием 10% повидон-йод раствор и 70% этанола. 2. Подготовка открытого черепа черепных окно Начиная 5 мм каудально по отношению к черепу, надрезать кожу головы с помощью ножниц, и двигаться вперед ни на сантиметр. Перемещение кожи по бокам, чтобы выставить череп. Для удаления оболочки в верхней части черепа применяется 10% раствор хлорида железа в верхней части черепа. Протрите излишки раствора и очистить от оболочки с углом 45 ° # 5 пинцетом. Важно, чтобы подготовить площадку тщательно, с тем чтобы обеспечить, что глава пластина может быть надежно прикреплены к черепу (шаг № 4 до 6). Используя микроскоп вскрытия, определить сферу интересов. Обратите внимание, что черепных швов следует избегать, поскольку череп сперерыв непредсказуемо в этом направлении. Нанесите тонкий слой быстрого клея (например, Locktite 454) по краям окна головой пластины (рис. 1). Установите пластину в голову таким образом, что область интересов выставляется в окно. Слегка надавите на голову тарелку. Нанесите небольшое количество зубной цемент для полимеризации клея быстро. Задержитесь на 10 секунд, в то время полимеризации клея. Нанесите небольшое количество клея, быстрое по краям окна, чтобы запечатать пластины головы и черепа. Винт головы пластину животного владельцу при вскрытии области. С помощью сверла Microtorque II установлен в 6000 оборотов в минуту и ​​IRF 005 сверло, удалить все лишние клей из черепа и от головы пластинку. Оставшийся клей на голове пластина должна быть удалена, так как в противном случае вмешиваться в крепление стеклянной крышкой. Установите сверло на 1000 оборотов в минуту, и начать бурение черепа, сделав круг в окне пластины головы, диаметр ~ 5 мм. Используйте легкие размашистыми движениями, как будто вы рисуете с очень мягким карандашом. Стоп бурения каждые 20-30 секунд, чтобы удалить пыль кости с помощью сжатого воздуха. Примечание: Форма отверстия в голове пластина позволяет дополнительно доступ к сверло (для левой и правой рукой хирург), которая облегчает создание круговой черепной окна. Кроме того, два необычной формы отверстий, обеспечивают необходимое пространство для вставки Кларк электрода или стекло-электрод в ткани головного мозга под черепной окно дополнительных полярографических или электрофизиологических измерений. Как бурения прогрессирует, норы формируется вокруг неповрежденной череп в центре. Будьте осторожны, чтобы не протыкать разбавленной череп, но сделать это нора одинаковой толщины. Будьте осторожны вокруг крупных кровеносных сосудов, они не должны быть скомпрометированы, и, если возможно, даже не коснулся. Используйте одну "ногу" пинцета # 3 поднимать ("смахнуть") кости в центре окна. Нанесите каплю artificIAL спинномозговой жидкости (aCSF) на окне. Протрите aCSF мягко использованием углу мягкой бумагой (например, Kimwipe). Обычно длительность поврежден в одном или нескольких местах по всему краю окна. Начиная с одного из этих сайтов, слегка приподнимите и снимите оболочку с поверхности мозга, используя под углом 45 ° пинцет № 5. При выборе сайта, с которого начинается удаление оболочки, избегать районов, прилегающих к крупных кровеносных сосудов. Если кровотечение происходит, применять капли aCSF и ждать в течение 2-3 мин при незначительных кровотечений остановить. Подготовить 0,07% легкоплавких агарозном растворяется в aCSF) Принесите расплавленный агарозном до температуры тела. Вытрите превышение aCSF от поверхности мозга. Вылейте агарозы в окно, и накрыть стекло. Нажмите на стекло аккуратно, чтобы контакт между стеклом и глава пластины, и ждать 10-20 секунд, пока агароза является твердым телом. Удалите излишки агарозы из стеклянной крышкой с помощью пинцета и мягкой бумажной салфеткой. Нанесите небольшоеКоличество быстрого клея вокруг стекла приклеить стекло на голову тарелку. Нанесите небольшое количество зубной цемент закрепить клеем (рис. 1). 3. Внутривенное введение и мониторинг оксигенации крови Примечание: Мы обычно используются в бедренную вену для внутривенного применения Техас красный, а не в хвостовую вену. Это потому, что бедренная вена инъекции обеспечения безопасной и воспроизводимой болюсного введения красителя. Поверните животных частично чрезмерно, чтобы выставить внутри левого бедра. Используйте ленту, чтобы обеспечить животным в этом положении. Применяют как антисептическое скраб, а затем 100% этилового спирта на кожу. Сделайте надрез вдоль медиального бедро от колена до лобкового симфиза. Отдельные мягкие ткани от тупой диссекции пинцетом № 5. Заполнить 1 мл шприц с 130 мкл Texas Red (2,5 мг / мл). Присоединить новую иглу (избыточное давление 30), и согните ее внимательно на 30 °, сохраняя наклон вверх. Заполните иглы шм Texas Red решение. При вскрытии микроскоп, вставить иглу в бедренную вену и вводят 100 мкл Texas Red. Удалите иглу и слегка нажмите вены марлей, чтобы остановить кровотечение. Закройте кожу с помощью 4-0 шва. Для постоянного мониторинга крови SpO 2 (для обеспечения адекватной оксигенации крови) разместить оксиметр зонд на правое бедро (от которого волосы были предварительно удалены). 4. Двухфотонного изображения Примечание: Мы используем Olympus Fluoview1000 многофотонной системы визуализации (вертикально) с Spectra-Physics Maitai HP DeepSee фемтосекундного Ti: Sa лазера источник возбуждения. Для обработки изображений, мы используем × 10 NA 0.45 (Zeiss C-Apochromat) или × 25 NA 1.05 (Olympus XLPlan N) воды погружения целей. Мы принимаем изображения на 12-битовую глубину с разрешением 512 × 512 пикселей с пиксель время задержки 2 мкс. NADH и Техас-красно-декстран которые одновременно возбуждение при 740 нм, и фторфлуоресценции отделяется от возбуждающего света помощью дихроичных зеркала / ближнем ИК-фильтр блокировки комбинации (FF665-DI01, FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, США) разделены на два канала помощью дихроичных зеркала (505DCXRU, Chroma , Rockingham, Вермонт, США) и полосовой фильтр (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Мощность лазера измерялась после того, как цель была 10-20 МВт для работы с изображениями в слое Я и 20-50 МВт для работы с изображениями в слое II. Передача хирургическим подготовленные мыши столик микроскопа. Возьмем начальное картина черепа сайт окна с помощью яркого освещения поля 4x увеличение для использования в качестве ссылки для регистрации карты с более высоким увеличением двухфотонного ангиографии. Увеличить на площади интерес использование × 10 увеличением. Выберите область интересов в корковых слоях я или II (до 150 мкм ниже пиальных поверхности). Если большем увеличении желательно, использовать × 25 целей Начало записи временных рядов (Фигуповторно 2). Мы рекомендуем использовать в среднем 3-5 кадров для повышения качества изображения. Вызвать гипоксемии путем добавления 50% N2 в воздухе, что животное дышит. Это приведет к O2 уровне до 10%. Убедитесь, гипоксемии, контролируя оксиметр данных. Продолжайте записывать временные ряды по гипоксемии (например, в течение 30 секунд), и после нормального уровня О2 восстанавливается. Сбор данных для расчета распределения кислорода путем выявления, измерения и количественного области гипоксии и кислородом тканей цилиндров вокруг кровеносных сосудов. 5. Обработка данных Определите Крог ткань цилиндр радиуса R. Это можно сделать вручную (рис. 3), измеряя расстояние между центром кровеносных сосудов и граница, на которой флуоресценции NADH обнаружено. Кроме того, использование вычислительной следователь независимо полуавтоматического определения тканевого цилиндра радиусом R и центрального Блоод судно т, что было описано ранее 1 дополнительный форме и представлены в разделе обсуждения этого протокола. Определите область гипоксия с использованием открытого доступа образ программного обеспечения для анализа, например, ImageJ. Для этого используйте NADH сигнал, определить порог, который очерчивает высокой интенсивности NADH области, а затем измерить площадь с повышенной флуоресценции NADH ткани. 6. Представитель Результаты Рисунок 2 показывает видео NADH / ангиографии изображения во время переходного гипоксемии (в формате PDF версия этой рис, отобранных фотографий были использованы). Вдыхаемой концентрации кислорода был снижен с 21% до 10% в течение 3 мин. Этот уровень экспериментально индуцированной гипоксемии достаточно, чтобы вызвать тяжелой гипоксии в коре головного мозга. Гипоксия ведет к увеличению флуоресценции NADH, первоначально в областях, которые были далеки от артериального кровоснабжения. Обратите внимание на резкое ткани NADHГраницы, которые представляют собой наблюдаемые границы ткани диффузии кислорода из коры микроциркуляцию. Изображение на рисунке 3 показана геометрия диффузии кислорода границы окружающих сосудов головного мозга. Это можно вывести Крог цилиндр диаметром от этих границ, как описано выше 1. Рисунок 1. (A) мышь с черепной окно подготовлены для работы с изображениями. (B) Размеры головы пластинку. Рисунок 2. Эндогенные NADH зеленая флуоресценция визуализированы с двухфотонного изображения через черепной окно, около 50 мкм ниже пиальных поверхности. Кровеносные сосуды визуализируются с Texas Red декстран. Кислорода во вдыхаемом воздухе снижается до 10% в течение 3 мин, а затем восстановлен на 21%. Шкала бар: 50 мкм. <IMG ALT = "3" SRC = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" /> Рисунок 3. Геометрия NADH флуоресценции границ. Желтый схеме показаны границы функциональной гипоксии, синие круги показывают прогнозам кислородом (Крог) цилиндров. Синие линии показывают цилиндр радиусом, цифры показывают, радиусов микрометров.