Qui noi descriviamo un metodo per visualizzare direttamente ipossia microregionale tissutale nella corteccia topo<em> In vivo</em>. Si basa su simultaneo a due fotoni imaging di nicotinammide adenin dinucleotide (NADH) e la microcircolazione corticale. Questo metodo è utile per l'analisi ad alta risoluzione di rifornimento tessutale ossigeno.
La capacità del cervello di funzionare ad alti livelli della domanda metabolica dipende dalla fornitura di ossigeno continuo attraverso il flusso di sangue e di ossigeno la diffusione dei tessuti. Qui vi presentiamo un protocollo sperimentale, visualizzato e metodologici per visualizzare direttamente microregionale ipossia tissutale e di dedurre gradienti di ossigeno perivascolari nella corteccia mouse. Essa si basa sulla relazione non lineare tra nicotinammide adenin dinucleotide (NADH) endogeno intensità di fluorescenza e la pressione parziale di ossigeno nel tessuto, dove osservato tessuto NADH fluorescenza aumenta bruscamente a livelli tissutali di ossigeno inferiore a 10 mmHg 1. Usiamo due fotoni eccitazione a 740 nm che permette per l'eccitazione contemporanea di fluorescenza intrinseca del tessuto NADH e plasma sanguigno in contrasto con Texas Red-destrano. I vantaggi di questo metodo rispetto agli approcci esistenti sono i seguenti: si avvale di un segnale tessuto intrinseca e può essere eseguita utilizzando standard a due fotoni in vivo iminvecchiamento apparecchiature, consente il monitoraggio continuo in tutto il campo di vista con una risoluzione profondità di circa 50 um. Abbiamo dimostrato che le aree di tessuto cerebrale più lontane dai vasi sanguigni cerebrali corrispondono alle zone vulnerabili spartiacque che sono i primi a diventare funzionalmente ipossica a seguito di una diminuzione dell'apporto di ossigeno vascolare. Questo metodo permette di immagine ossigenazione microregionale corticale e quindi è utile per esaminare il ruolo di rifornimento tessutale inadeguata o limitata di ossigeno nelle malattie neurovascolari e ictus.
Informazioni ad alta risoluzione spaziale sulla diffusione dell'ossigeno è importante per capire come il flusso di sangue nel cervello è regolato per fornire ossigeno alle cellule cerebrali, e per soddisfare la domanda metabolica. Tradizionali misure di ossigeno polarografiche con Clark in stile elettrodi di vetro sono altamente invasivi e hanno una bassa risoluzione spaziale 2-3 e tempo di risposta significativa (secondo intervallo). Finora l'unico metodo non invasivo per la misurazione della pO 2 nel tessuto cerebrale è quenching fosforescenza, dove il tasso di decadimento della sonda eccitato è proporzionale alla concentrazione di ossigeno 4. Questo metodo fornisce concentrazioni di ossigeno accurate, ma richiede un colorante di proprietà e una fosforescenza tecnicamente sofisticato sistema di imaging vita. Qui, dimostrano un approccio semplice e più semplice che può essere condotta su uno standard a due fotoni sistema di imaging con due canali flurescence. Il nostro approccio si avvale di un segnale tessuto intrinseca 5 bisnd richiede solo la visualizzazione di contrasto della microcircolazione corticale. A causa della non-lineare, aumento essenzialmente binario di NADH fluorescenza a funzionalmente limitare concentrazioni di ossigeno 1, aumentata fluorescenza intrinseca NADH è stata osservata solo in aree con significativa, ipossia metabolicamente limitativo. Un'importante implicazione è che i confini dei tessuti di diffusione dell'ossigeno da microvasi corticali sono direttamente osservabili dalle variazioni di intensità cilindrica a forma di fluorescenza endogena NADH. Ci riferiamo a queste strutture come cilindri Krogh, perché il concetto di strutture a forma cilindrica che definiscono il volume ossigenato di tessuto che circonda un vaso sanguigno è stato introdotto da August Krogh ed è stato recentemente osservato sperimentalmente con due fotoni NADH immagini 1. Cilindri Krogh immagini possono essere raccolte in 3D prendendo una z-pila di fotogrammi dell'immagine. Sono particolarmente importanti in prossimità di arteriole penetranti e sono spirito congruoh capillare impoverito periarteriolar cilindri 1,4 tessuti.
Per fornire una determinazione obiettivo del raggio R tessuto Krogh cilindro (v. punto 5.2) sono stati misurati i valori di intensità dei pixel radiali all'interno di una ben definita segmento tra il centro del cilindro e il contorno esterno utilizzando la funzione di Matlab "improfile". Il contorno esterno del segmento dovrebbe essere scelto per estendere con un margine di sicurezza al di là del limite visibile. Per migliorare il rapporto segnale-rumore livello che averageed su tutte le linee radiali necessari per coprire il segmento visibile cilindro a passi di 1 °. La risultante profilo di intensità media radiale all'interno del segmento mostrato un forte aumento che corrispondeva al confine R visibile tessuto. Il abbiamo adattare una funzione sigmoidale (es funzione Boltzmann) al profilo di intensità mediati radiale e usato suo punto di flesso (noto anche come x 0) come definizione di R. Il corrispondente a due photon microangiography (Texas-rosso) hanno rivelato la sezione trasversale di un vaso sanguigno solitario centrale nel centro del cilindro. Il diametro del vaso sanguigno centrale può essere direttamente applicato per determinare r.
Due fotoni NADH immagini offre la stessa risoluzione spaziale come la concomitante imaging ad alta risoluzione del microangiography corticale. Una caratteristica importante per l'applicazione quantitativa di questo metodo è che p 50 del NADH aumento di fluorescenza è stata misurata per essere di 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 e che l'intensità di NADH fluorescenza in funzione del tessuto microregionale pO 2 può essere matematicamente descritto con una funzione sigmoidale. . Abbiamo dimostrato che questa tecnica permette di identificare le aree cerebrali che sono più vulnerabili a ipossia (diminuendo il contenuto di ossigeno nell'aria al 10%). Mostriamo anche che la diffusione di ossigeno segue un modello semplice perivascolare geometrico.
Una critpasso iCal per questo metodo è la qualità della preparazione finestra cranica. La chirurgia dovrebbe produrre un danno minimo per non disturbare il flusso di sangue alla zona esposta. Una preoccupazione è che in una preparazione chirurgicamente compromesso, la corteccia sotto la finestra può essere ipossico per cominciare, precludendo qualsiasi esperimenti significativi. A ben preparato finestra cranica dovrebbe avere intatte vasi sanguigni maggiori e minori, con il flusso di sangue vivido in tutti i tipi di navi e nessun sanguinamento significativo lungo i bordi. In condizioni di normossia (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%), il parenchima cerebrale deve presentare uniforme, fluorescenza omogenea NADH cospicui, senza chiazze luminose con tessuti a fluorescenza NADH elevata.
Un vincolo fisico fondamentale del nostro approccio è limitata penetrazione in profondità. Il blu-verde fluorescenza NADH nel cervello è rapidamente attenuato di scattering e di assorbimento dell'emoglobina tessuto a queste lunghezze d'onda. Anche con elevata apertura numerica (per esempio 1,05) acquaobiettivi ad immersione a due fotoni NADH immagini è attualmente limitata a strati corticali I e II. Questa limitazione è scientificamente rilevante in quanto il metabolismo energetico o in prossimità di materia bianca sarà probabilmente diverso dalla materia grigia. Tuttavia, l'indagine di profonde strutture corticali come strati IV-VI o strutture sottocorticali quali tratti di sostanza bianca o striato richiederebbe l'uso di microlenti specializzati come descritto nella corteccia topo in vivo 6.
NADH-based misurazione dei confini di diffusione di ossigeno può essere particolarmente utile se combinato con altre misure, quali analisi di iperemia funzionale, e la rilevazione dei tassi di flusso capillare 7. Ad esempio, questa tecnica può essere adattato per visualizzare ipossia in ictus e malattia di Alzheimer (AD) modelli. La geometria semplice diffusione di ossigeno permette di prevedere il gradiente di ossigeno nel letto microvascolari in circostanze in cui la densità capillare è deaumentata 8 (per esempio, AD 9) e di esaminare se le regioni di tessuto cerebrale con ridotta densità capillare sono ad aumentato rischio di danni a causa di ipossia microstrokes. La capacità di immagine microregionally permette anche di esaminare la geometria e le dimensioni dei microstrokes tessuti e determinare il volume del tessuto in cui si verifica ipossia, nonché il rapporto tra ipossia tissutale e successiva morte neuronale o rimodellamento capillare 10.
Infine, dato che aumenta a fluorescenza endogena NADH sono la conseguenza diretta di acuta disfunzione mitocondriale, questo metodo crea l'opportunità di utilizzare l'imaging NADH come reporter specifico per il metabolismo energetico neuronale 11 e un proxy per la disfunzione mitocondriale.
In conclusione, a due fotoni immagini di fluorescenza endogena NADH è uno strumento semplice, poco impegnativo che può essere utilizzato per comprendere l'apporto di ossigeno e il consumo nel cervello normale sia sottoe negli stati patologici.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) per la progettazione piastra di testa. Il lavoro è stato sostenuto da premi NIH a SD (R01DA026325 e P30AI078498 e sovvenzioni per KK (DANA Brain Foundation e del programma Immunoimaging, American Heart Association 0635595T e l'Associazione ALS [# 1112)]).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer | ||
Povidone-iodine 10% solution | Betadine | ||
Ferric chloride 10% solution | |||
Cement | Stoelting Company | 51456 | |
Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
Microtorque II handpiece kit | Pearson | R14-0002 | |
IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
#0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | HC125-02 | |
Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Spectra-Physics |