Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

1. Voorbereiding van het dier voor de beeldvorming Let op: We maken gebruik van volwassen C57BL muizen. Verschillende transgene stammen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Microvasculaire operaties en pulsoximetrie worden gefaciliteerd in muizen met een witte vacht (bv. FVB-stam). Bereid de chirurgische site op de bank. Alle chirurgische instrumenten moeten worden geautoclaveerd of gedesinfecteerd met 70% ethanol. Plaats een rectale sonde, en voortdurend van het dier lichaamstemperatuur te meten tijdens de gehele procedure Verdoof de muis met behulp van in eerste instantie 5% isofluraan. In 15-30 s, Als het dier niet in beweging is, leg het op een verwarmingselement (37 ° C), en pas een gezichtsmasker voor de continue toediening van lucht met 1,3-1,5% isofluraan). Zorg ervoor dat het dier niet reageert op een pijnprikkel (bv staart knijpen). Gebruik kunstmatige traan gel om de muis van de ogen te bedekken, om blootstelling aan droge lucht te voorkomen. Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, verwijder haar from het hoofd en van beide dijen. Breng haar remover (bijv. Nair) om de dij gedurende 2 minuten, en dan voorzichtig veeg het om de resterende haren te verwijderen. Dit dij zal worden gebruikt voor oximetrie. Desinfecteren de hoofdhuid met een 10%-ige povidonjood-oplossing en 70% ethanol. 2. Voorbereiding van het open schedel schedel venster Vanaf 5 mm caudaal van de schedel, maakt een sneetje in de hoofdhuid met een schaar, en vooruit een centimeter. Verplaats huid aan de zijkanten om de schedel bloot te leggen. Om de membranen te verwijderen op de schedel toepassing 10%-oplossing naar de top van de schedel. Veeg de overtollige oplossing, en weg te schrapen van de membranen met 45 ° hoek # 5 pincet. Het is belangrijk om de plaats nauwkeurig op te stellen, zodat de kopplaat kan stevig worden bevestigd aan de schedel (de stappen 4-6). Met behulp van een dissectie microscoop te identificeren op het gebied van belang. Merk op dat de schedelnaden moet worden vermeden, omdat de schedel ceen onvoorspelbaar breken in deze richting. Een dunne laag van snelle lijm (bijv. Locktite 454) langs de randen van het raam van de kopplaat (figuur 1). Plaats de kopplaat zodanig dat het gebied van belang is blootgesteld in het venster. Breng lichte druk op het hoofd plaat. Breng een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement om de lijm te snel te polymeriseren. Houd gedurende 10 seconden, terwijl de lijm wordt polymerisatie. Een kleine hoeveelheid van snelle lijm op de randen van het raam van de kopplaat en de schedel dichten. Schroef de kop plaat om het dier houder onder de dissectie scope. Met behulp van de Microtorque II boor vastgesteld op 6000 rpm en een IRF 005 boor, verwijder alle extra lijm van de schedel en van het hoofd plaat. Eventuele resterende lijm op het hoofd plaat dient te worden verwijderd, omdat ze anders interfereren met de bevestiging van de glazen afdekplaat. Zet de boor bij 1000 rpm, en start het boren van de schedel door het maken van een cirkel in het hoofd plaat venster, een diameter van ~ 5 mm. Gebruik licht strijkende bewegingen alsof je tekenen met een zeer zacht potlood. Stop met het boren van elke 20-30 seconden op het bot stof met behulp van perslucht te verwijderen. Opmerking: De vorm van de opening in de kop plaat maakt het mogelijk extra toegang voor de boor (voor links-en rechtshandig chirurg), wat maakt het makkelijker om een ​​ronde schedel venster te maken. Bovendien zijn de twee oneven gevormde gaten de benodigde ruimte voor een Clark-elektrode of glas-electrode te voegen in het hersenweefsel onder de schedel venster extra polarografische of elektrofysiologische metingen. Zoals het boren voortgaat een hol gevormd rond de intacte schedel in het midden. Wees voorzichtig niet te porren door de verdunde schedel, maar om dit hol van gelijke dikte te maken. Wees extra voorzichtig rond de grote bloedvaten, ze mogen niet worden aangetast en, indien mogelijk, zelfs niet aangeraakt. Gebruik een "been" pincet # 3 heffen ("beweeg off") het bot in het midden van het venster. Breng een druppel artificial cerebrospinale vloeistof (aCSF) op het raam. Veeg aCSF voorzichtig met een hoek van zacht weefsel papier (bijvoorbeeld Kimwipe). Gewoonlijk de duur beschadigd in een of meer plaatsen langs de rand van het raam. Vanaf een van deze sites, til en dan de dura te verwijderen uit de hersenen oppervlak, met behulp van hoek van 45 ° pincet # 5. Bij de keuze van de plaats waar beginnen verwijderen dura, voorkomen de gebieden grenzend aan grote bloedvaten. Als er een bloeding optreedt, breng dan een druppel aCSF en wacht 2-3 minuten voor kleine bloedingen te stoppen. Bereid 0,07% bij lage temperatuur smeltende agarose opgelost in aCSF) de gesmolten agarose Breng aan de lichaamstemperatuur. Veeg de overmaat aCSF van het oppervlak van de hersenen. Giet de agarose in het venster, en dek af met een glasplaatje. Druk zachtjes op het glas om een ​​contact tussen het glas en het hoofd plaat te maken, en wacht 10-20 sec tot de agarose is solide. Verwijder het teveel aan agarose uit de glazen afdekplaat met een pincet en het zachte weefsel papier. Zet een kleinehoeveelheid van snelle lijm rond het glas te lijmen het glas naar het hoofd plaat. Breng een kleine hoeveelheid van tandheelkundige cement om de lijm (figuur 1) stollen. 3. Intraveneuze injectie en bloedoxygenatie controle Let op: Wij routinematig gebruikt de lies voor intraveneuze toepassing van Texas rode in plaats van de staartader. Dit komt omdat dijader injecties een veilige en reproduceerbare bolusinjecties van de kleurstof. Draai het dier gedeeltelijk naar de binnenzijde van de linkerdij bloot. Gebruik tape om het dier veilig te stellen in deze positie. Breng antiseptische scrub, en vervolgens 100% ethanol voor de huid. Maak een insnijding langs de mediale dij van de knie tot het bekken. Aparte zachte weefsels door stompe dissectie met een pincet # 5. Vul 1 ml spuit met 130 ul van Texas Red (2,5 mg / ml). Bevestig een nieuwe naald (gauge 30), en zorgvuldig buig het op 30 °, het bijhouden van de schuine kant op. Vul de naald wie Texas Red oplossing. Onder een dissectie microscoop, steek de naald in de lies en injecteer 100 ul van Texas Red. Verwijder de naald en licht de ader drukt u op met een gaasje om het bloeden te stoppen. Sluit de huid met behulp van 4-0 hechtdraad. Voor continue bewaking van het bloed SpO 2 (voldoende bloedoxygenatie te garanderen) plaats de oximeter sonde op de rechter dij (waar haar werd eerder verwijderd). 4. Twee-foton beeldvorming Opmerking: Wij maken gebruik van een Olympus Fluoview1000 multifoton imaging-systeem (rechtop) met een Spectra-Physics Maitai HP DeepSee femtoseconde Ti: Sa laser als een excitatie bron. Voor de beeldvorming, gebruiken we × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), of × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) water-onderdompeling doelstellingen. We nemen beelden 12 bitdiepte met een resolutie van 512 x 512 pixels met een pixelverblijftijd van 2 ps. De NADH en Texas-Rood-dextran gelijktijdig enthousiast op 740 nm, en fluorescence is gescheiden van het excitatie licht met behulp van een dichroïsche spiegel / nabij-IR-sperfilter combinatie (FF665-DI01, FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA), verdeeld in twee kanalen met behulp van een dichroïsche spiegel (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA), en de bandbreedte gefilterd (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laservermogen gemeten na de doelstelling 10-20 mW voor beeldvorming bij laag I en 20-50 mW voor beeldvorming bij laag II. Breng de chirurgisch voorbereid muis om de microscoop podium. Neem een ​​eerste beeld van de schedel venster site met behulp van helderveld verlichting met 4-voudige vergroting om als referentie kaart voor registratie te gebruiken met een hogere vergroting twee-foton angiografieën. Zoom in op het gebied van belang aan de hand × 10 vergroting. Een gebied van belang in corticale lagen I en II (tot 150 pm onder het oppervlak pial). Als er een hogere vergroting gewenst is, gebruik dan × 25 doel Begin op te nemen de tijdreeks (FiguAd 2). Wij raden een gemiddelde van 3-5 frames om de kwaliteit van het beeld te vergroten. Induceren hypoxie door toevoeging van 50% N2 in de lucht het dier ademt. Dit zal het O2-niveau tot 10%. Controleer of hypoxemie door het bewaken van oximeter gegevens. Blijf de tijdreeksen op te nemen door middel van hypoxie (bijvoorbeeld voor 30 seconden), en na de normale O2-niveau is hersteld. Verzamel gegevens voor de berekening van de zuurstof die de distributie door het detecteren, meten en kwantificeren van de oppervlakte van hypoxie en zuurstofrijk weefsel cilinders rond de bloedvaten. 5. Gegevensverwerking Bepaal de Krogh weefsel cilinder straal R. Dit kan manueel (figuur 3) door de afstand tussen het middelpunt van het bloedvat en de grens waarbij hoge NADH fluorescentie wordt waargenomen. U kunt ook de computationele onderzoekers onafhankelijk semi-automatische bepaling van het weefsel cilinder straal R en de centrale blood schip r dat al eerder is beschreven in een aanvullende vorm en samengevat in de bespreking van dit protocol. Bepaal het oppervlak van hypoxie met behulp van open-access beeldanalyse software, bijvoorbeeld ImageJ. Om dit te doen, gebruik maken van NADH-signaal, definieert u een drempel die de hoge NADH intensiteit gebied afbakent, en meet vervolgens het gebied met verhoogde NADH weefsel fluorescentie. 6. Representatieve resultaten Figuur 2 toont een video van NADH / angiografie beelden tijdens de voorbijgaande hypoxemie (voor de PDF-versie van deze figuur, geselecteerde foto's zijn gebruikt). De zuurstof concentratie werd verlaagd van 21% naar 10% voor een periode van 3 minuten. Dit niveau van experimenteel geïnduceerde hypoxemie is voldoende om ernstige hypoxie te induceren in de cerebrale cortex. Hypoxie leidt tot een toename van NADH fluorescentie, eerst in de domeinen die het verst van de arteriële bloedtoevoer. Let op de scherpe NADH weefselgrenzen, die waarneembare weefsel grenzen van zuurstofdiffusie vormen van de corticale microcirculatie. Het beeld in figuur 3 de geometrie van zuurstofdiffusie grenzen rond cerebrale bloedvaten. Het is af te leiden Krogh cilinder diameters van deze grenzen, zoals eerder beschreven 1. Figuur 1. (A) Muis met schedel venster voorbereid voor de beeldvorming. (B) Afmetingen van het hoofd van plaat. Figuur 2. Endogene NADH groene fluorescentie zichtbaar gemaakt met twee-foton beeldvorming door middel van craniale raam, ongeveer 50 urn onder het pial oppervlak. Bloedvaten worden gevisualiseerd met Texas Red dextran. Zuurstof in ingeademde lucht werd verlaagd tot 10% gedurende 3 minuten, en dan hersteld voor 21%. Schaal bar: 50 pm. <img alt = "Afbeelding 3" src = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" /> Figuur 3. Geometrie van NADH fluorescentie grenzen. Geel schets toont grens van functionele hypoxie; blauwe cirkels geven geprojecteerd zuurstof (Krogh) cilinders. Blauwe lijnen geven cilinder stralen; cijfers laten zien stralen in micrometers.