1. Cel Cultuur De GL26 cellijn werd verkregen uit de deling van kankercellen behandeling en diagnose (DCTD) National Cancer Institute (NCI), Frederick, MD. Ter bevordering van een kwantitatieve meting van de tumor groei GL261 cellen werden gemaakt bioluminescente het gebruik van de Lentiphos HT System (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) met de Lenti-X HT Packaging Mix (Clontech Laboratories, Inc) en de FUW- GL plasmide (een gulle gift van het laboratorium van JB Rubin, MD, PhD). Cellen werden gehandhaafd in Medium Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) met 10% tetracycline-vrij Foetaal Calf Serum (FCS, Clontech Laboratories, Inc.) GL261 cellen werden ook stabiel getransfecteerd met het gen dat codeert voor luc2 het gebruik van de pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] vector (Promega Corp, Madison, WI) en Fugene 6 transfectiereagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) naar aanleiding van de voorwaarden vastgelegd door de fabrikant. De luc2 gen is een codon geoptimaliseerde versie van firefly Luciferase dat een aanzienlijk hogere lichtopbrengst dan de standaard luc gen verschaft. Stabiele transfectanten werden geselecteerd en in stand gehouden in DMEM medium met 10% FCS en 100 ug / ml Geneticine (G418, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA). Voorafgaand aan de implantatie van de gekweekte cellen worden geoogst door trypsinzation, eenmaal gewassen in DMEM zonder serum en geresuspendeerd in DMEM zonder serum bij een concentratie van 1 x 10 7 cellen / ml. 2. Chirurgie Setup 2 Een steriele omgeving is gedurende de gehele operatie, met inbegrip van alle chirurgische instrumenten, supplies, handschoenen, gordijnen, etc.. Van tien weken oud C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (albino C57BL / 6) muizen zijn gekocht van het National Cancer Institute in Frederick Dierlijke Productie Program en gebruikt bij een gemiddeld gewicht van 20 gram (NCI, Frederick, MD). Dieren zijn verdoofd door intraperitoneale injectie van xylazine (5 mg / kg), ketamine (50 mg / kg) en buprenorfine (0,05 mg / kg). Naare snufje is gedaan om ervoor te zorgen dat het dier voldoende verdoofd is voor de operatie is begonnen. Beweging (zelfs als lichte) van enig deel van het dier is een indicatie van een vermindering van het niveau van de anesthesie. Dier wordt direct gegeven een extra 3,3 mg / kg xylazine en 26,6 mg / kg ketamine. Lichaamstemperatuur is onderhouden met behulp van een lamp en steriele verbanden met betrekking tot het lichaam. Zodra het dier goed is verdoofd, worden ze geplaatst op de gedempte bed van de stereotactische headframe (Model 900 Small Animal stereotaxische, David Kopf Instruments) [Figuur 1]. Een kleine hoeveelheid (1 / 4 inch) van AKWA Tears Oogheelkundige Glijmiddel Zalf wordt toegepast over de hoornvliezen. Het dier wordt vastgezet in het stereotactische frame door het openen van de mond van het paard (door het plaatsen van je wijsvinger en duim rond de kaak van het dier) en schuif de bovenste voortanden in de inkeping in de stereotactische frame. De klem wordt aangehaald om het dier het hoofd veilig in de headset en zorg ervoor dat ee kop is uitgelijnd en de ogen zijn gecentreerd, zorg ervoor dat echter niet te veel kracht uit te oefenen op het hoofd van het dier. De O 2 slang is vastgeplakt in de buurt van neusgaten van het dier. Zuurstof debiet is 0,5 l / min. De lage rug en de staart is vastgeplakt aan de stereotactische bed zorg dat u ademhaling compromis. De chirurgische incisie site is geschoren. Povidine-Jodium Swab Sticks worden gebruikt om het gebied te wassen tussen de ogen terug te gaan naar het gebied tussen de oren met jodium, zorg ervoor dat het jodium niet druppelt in de ogen van het dier. De cellen zijn voorbereid op de implantatie net voor de operatie en worden periodiek gemengd te zorgen dat ze geen genoegen. Een 10 pi, is 50 mm Wereld precisie-instrument (WPI), Sarasota, FL, injectiespuit met 26 gauge naald schuin geladen met de cel inoculum. Als de cellen lijken om samen te zijn samengeklonterd kan het nodig zijn om de spuit opnieuw te laden. De 10 pi spuit is vervolgens geplaatst in de UMP3-1 ultramicroPump micro-injector (WPI, Sarasota, FL). 3. Intracraniële Implantatie 2 De huid incisie wordt gemaakt met behulp van een maat 15 scalpel en pincet getand. Een 10-15 mm incisie wordt gemaakt van de lengte tussen de dieren in de ogen, de richting van de oren van het dier het blootstellen van de bregma (kruising van de sagittale en coronale hechtingen aan de bovenkant van de schedel). Zorg ervoor dat u de juiste identificatie van de bregma voor het gemakkelijk kan worden verward met de sinus gebied dat distaal van de bregma [figuur 2]. Nadat het dier is verdoofd ontvangt een intra-incisie injectie van 0,25% (2,5 mg / ml) bupivacaïne. Een burrhole is 0,1 mm achter bregma en 2.3 mm naar rechts van de middellijn door langzaam te draaien een 16 gauge 1 ½ inch naald met de hand, het toepassen van weinig druk om de naald tijdens het draaien totdat de schedel is doorgedrongen en de hersenen is blootgesteld. De naald wordt bewogen naar beneden in positie met behulp van de microdrive stereotactic spuithouder totdat deze net van de hersenen oppervlak. Vanuit deze positie, is de naald gevorderd in de hersenen tot een diepte van 3 mm en op zijn plaats gehouden gedurende 3 minuten. De naald is teruggetrokken 0,4 mm tot een totale diepte van 2,6 mm onder het oppervlak van de hersenen, het creëren van een klein zakje waar de cellen dienen te worden toegediend. Het is optioneel op dit punt om een X-ray beeld van de naald in het dier te nemen om de juiste plaatsing en diepte te verzekeren. De celsuspensie wordt toegediend gedurende 3 minuten met de micro-injector ingesteld op een volume van 2000 nL (2 pi) met een infusiesnelheid van 667 nL / minuut. De naald is blijven zitten gedurende 2 minuten om lekkage te voorkomen dat de plaats van infusie. De naald wordt langzaam volledig ingetrokken. De burrhole is gevuld met bot was met behulp van een Penfield dissector. De incisie wordt gehecht met behulp van een 4-0 (1.5 metrisch) Vicryl hechtingen ervoor te zorgen dat geen grote lacunes vertoont de huid. Vicryl is een hechtmateriaal die oplossens, en daarom hechtingen hoeven niet verwijderd te worden wanneer de incisie is genezen. Na de operatie zijn de dieren in een kooi onder een warmte lamp die is ingesteld op de vereiste hoogte tot de onderkant van de kooi warm tot 30 ° C. Wanneer de dieren worden helemaal wakker (zoals beoordeeld door de normale beweging in de kooi), zij worden teruggestuurd naar groepshuisvesting. Oraal ibuprofen wordt toegevoegd aan hun drinkwater gedurende 5 dagen post-operatief. 100 mg van kinderen ibuprofen (100mg/5ml) wordt toegevoegd aan een standaard 473 ml water knaagdier fles. Dieren zijn waargenomen per dag en belicht en gewogen om de 3 dagen. Twee weken na de implantatie observatie is verhoogd naar twee keer per dag. Dieren worden gedood als ze tekenen van afnemende gezondheid, die gebogen houding, verminderde mobiliteit en zichtbare lichaam gewichtsverlies (≥ 20%) omvat. Deze symptomen zijn een gepubliceerde reactie op de tumor en ze reproduceerbaar verschijnen ongeveer 1 dag voor de dood als gevolg van de tumor. 4. In vivo </em> Bioluminescentie Imaging 3 Start de [Living Image] software. De IVIS Imaging System is geïnitialiseerd door te klikken op de [Initialiseren IVIS Systeem] knop aan de onderkant rechts van het bedieningspaneel. Selecteer de [Luminescent] Imaging Mode op de linker bovenkant van het bedieningspaneel. Voor het bepalen van de optimale tijd van beeldvorming na luciferine injectie een kinetische studie noodzakelijk is [figuur 3]. Deze beschrijving is voor de vuurvlieg luciferase; Injecteer 10μl / g lichaamsgewicht van D-luciferine firefly (15mg/ml in PBS; Caliper Life Sciences Winkel XR-1001 of een soortgelijk product van een andere leverancier) in het dier, zoals hieronder beschreven. Wacht drie minuten, en daarna verdoven met de muis door het plaatsen van het in de gas anesthesie kamer (2% Isofluraan gas in O 2). Zet het gas verdoving naar de kamer en open de anesthesie klep en het vacuüm om de IVIS spruitstuk. Onmiddellijk plaats van de verdoving van dierenvan de temperatuur gecontroleerde imaging platform, zorg ervoor dat de muis neusgat juiste manier is geplaatst in het gas anesthesie spruitstuk. Het eerste beeld moeten worden genomen ongeveer 5 minuten na de luciferine injectie. Tot 5 dieren kan worden afgebeeld op een bepaald moment in de IVIS Spectrum instrument. Als er minder dan vijf dieren af te beelden, is het mogelijk om het ongebruikte spruitstuk (s) stekker voor het behoud van isofluraan gas. Blijf foto's maken om de 3 minuten door het creëren van een sequentie voor maximaal een uur aan een kinetische curve voor luciferin expressie te genereren. Klik op de [Sequence Setup]-knop in het bedieningspaneel. Het sequence editor verschijnt. In het bedieningspaneel, geeft u de instellingen voor de eerste lichtgevende beeld in de reeks. We raden aan te beginnen met Medium binning. Wij bevelen ook het Auto-Blootstelling aan de optimale belichtingstijd te bepalen. Selecteer de [Vertraging] knop in de sequence editor eennd geeft een vertraging van 3 minuten tussen elke overname. Klik op [Toevoegen] in het sequence editor. Acquisitie parameters worden dan toegevoegd aan de tabel. Herhaal stap 4 voor elk beeld in de reeks. Zodra de curve is gevestigd, kan de optimale beeldvorming tijd worden bepaald door het plotten van de signaalsterkte (intensiteit) tegen de tijd. Afbeelding dieren ten tijde van de hoogste in vivo foton tellen de sterkste en meest nauwkeurige signaal te krijgen. Vroege experimenten gebruikte intraperitoneale (ip) injectie van luciferine, echter, ip injecties soms resulteerde in intermitterende resultaten tonen weinig tot geen bioluminescentie in de tumor. Onze hypothese was dat het af en toe een willekeurige ontbreken van het signaal was te wijten aan de levering van de luciferine aan de darm of andere interne organen. Wij zijn dan ook begonnen met subcutane (sc) luciferine injecties te gebruiken en zag een grotere imaging reproduceerbaarheid [figuur 3]. Twintigminuten na sc injectie, de dieren worden verdoofd door ze in een kamer met 2% isofluraan gas in O 2 tot ze reageert. De verdoofde dier (en) worden verplaatst naar de beeldvorming kamer. Oogheelkundige zalf moet worden gebruikt voor de kinetische studie vanwege de lengte van de beeldvorming. Het is niet nodig voor de andere beeldvormende procedures, omdat ze zijn van korte duur. Het beeld is verkregen op medium binning met een 5 minuten belichtingstijd. De auto overname optie kan ook worden gebruikt. Als het signaal is verzadigd en / of flauwvallen bij medium binning, kan binning of belichtingstijd worden aangepast. De programmabestanden en de daarop volgende afbeelding commentaren worden opgeslagen in de computer van de gebruiker. 5. 3D Imaging 3 Klik op de [Imaging Wizard] tab in de [Sequence Setup]-venster van het bedieningspaneel. Selecteer de [Bioluminescentie] imaging-modus op de Imaging Wizard startscherm en click [Volgende]. In het "Bioluminescentie – DLIT" venster van de imaging wizard het selectievakje [Firefly] reporter sonde. De emissie / excitatie van de geselecteerde firefly bron spectrum zal verschijnen met de zes bijbehorende filter selecties te verwerven. Het laatste scherm zal verschijnen met de standaard keuzes die Automatische belichting acquisitie parameters en een van Field of View C. De standaardinstellingen werken heel goed zijn, maar deze instellingen kunnen worden aangepast indien nodig. Klik op [Volgende] en de sequence editor venster wordt gevuld met de volgorde van de zes spectrale gebieden bij 20 nm breed filters (560 nm, 580 nm, 600 nm, 620 nm, 640 nm en 660 nm). Druk op [Acquire Sequence]. Het eerste filter (560 nm) zal een gestructureerde lichtpatroon met behulp van een laser galvanometer aan de oppervlakte topografie vast te stellen. Selecteer de [Surface Topography] tab in de Tool Palette. Het oppervlak glad kan worden toegepast om eventuele scherpe hoeken die tijdens het proces van wederopbouw. Destandaard lage smoothing wordt aanbevolen. Klik op [Create] en de tomografie analyse box zal verschijnen. Teken een gewas box die het volledige dier bevat en klik op [Volgende]. De drempel tool zal verschijnen als een paarse masker over de geselecteerde regio. Het masker wordt automatisch ingesteld op de foto van het dier wedstrijd. Indien nodig past u de drempel van het masker om meer adequaat passen bij de omtrek van het dier. Klik op [Finish] en de gereconstrueerde mesh zal verschijnen. De reconstructie kan vervolgens worden opgeslagen in de resultaten tabblad. Na de oprichting van het oppervlak van het dier topografie, ga dan naar de [DLIT 3D-reconstructie] drop-down op de Tool Palette. Onder de [Analyse] tabblad selecteer alle zes golflengten aan de wederopbouw uit te voeren. Hef de selectie van beelden die verzadigde pixels of tellingen leverden onder de 600. Laat de instellingen in het [Parameters] tab als standaard. Onder het tabblad [Eigenschappen], moet "Muscle" worden als de standaard keuze voorr Tissue op Eigenschappen en "Firefly" moeten worden vermeld als de bron spectrum. Klik op [Reconstrueer] onder het tabblad Analyseren, en de 3D-reconstructie van het oppervlak van het dier en de bijbehorende reconstructie van de signaalbron dient [figuur 4] worden weergegeven. Voor het bepalen van het signaal plaats en intensiteit, selecteert u de voxels knop op de 3D-tabblad Hulpprogramma's van de Tool Palette. Teken een vierkant rond alle voxels worden weergegeven en de totale flux metingen is te zien in de bodem van het volume tabblad. Klik op [Center of Mass] om het signaal locatie van de geselecteerde voxels te identificeren. Coronale, sagittale en transaxiaal plakjes van het dier zal verschijnen en het gebruik van de [Measurement Cursor Display] de afstand tot het oppervlak van de dieren aan de voxel centrum kan worden gemeten. Raadpleeg de handleiding van het levende beeld softwarehandleiding voor meer informatie over co-registratie van orgel atlassen en andere geavanceerde functies. 6. Gegevens EenNALYSE 3 Nadat de afbeelding is overgenomen en opgeslagen, toegang tot het programma-bestand door te klikken op de knop [Browse] en het bestand te selecteren. Het beeld informatie is te vinden onder [View] → [Afbeelding Information]. De intensiteit van het signaal kan worden gekwantificeerd door het selecteren van de regio Of Interest (ROI) [ROI Tools]-knop. Zorg ervoor dat het beeld geanalyseerd onder de [Photon] modus door te kiezen voor "Photon" op de drop-down menu aan de linker bovenhoek van het beeld bedieningspaneel. Selecteer de [Measurement ROI] knop in het "Type" drop-down lijst. Selecteer de ROI vorm van belang; opties omvatten Cirkel, Ruit, en of Grid. Bestrijkt alle gebieden van intensiteit op de verworven beeld. De ROI positie is ingesteld door het slepen van de ROI vorm van selectie aan de regio waarin de lichtgevende signaal. Het signaal intensiteit van de ROI wordt berekend door op de [Measure]-knop. De ROI-label geeft de intensiteit. ROI's kunnen worden beheerd en opgeslagen using van de Living Image software. 7. Representatieve resultaten: Succesvolle cel implantatie is duidelijk wanneer geïmplanteerde cellen worden opgespoord met behulp van de IVIS spectrum op de dag van de operatie. Zowel de GL261 en GL261-luc-luc2 cellen detecteerbaar zijn, echter, zal de luc2 gen zorgen voor een hoger niveau van bioluminescentie [figuur 5]. Beelden genomen kort na implantatie kunnen niet-specifieke signalering op poten van het dier en de neus die moeten worden genegeerd als achtergrond. Het signaal op de plaats van implantatie is echt en het signaal zal toenemen met de tijd [figuur 6]. De daling van de signaalintensiteit op dag 6 reproduceerbaar is en het meest waarschijnlijk te wijten aan het verlies van tumor te nemen door een deel van de geïmplanteerde cellen. Kwantitatieve metingen van tumorlast reproduceerbaar zijn in dat ze steeds moeten stijgen totdat het dier uiteindelijk bezwijkt aan de ziekte. Echter, zal de groei curves grotendeels afhangen van de toestand van de geïmplanteerde cellen, en of onvermijdelijke kleine var ANSPRAKELIJKHEID in de implantatie procedure. Ons laboratorium heeft ervoor gekozen om de afbeelding geïmplanteerde dieren om de drie dagen. Figuur 1. Nadat de muis is goed verdoofd, wordt het geplaatst in de stereotactische frame. De muis hoofd is beveiligd met de mond klem. Figuur 2. Nadat de huid geopend is de belangrijkste anatomische oriëntatiepunten zijn geïdentificeerd waaronder onder meer de bregma, de coronale en sagittale hechtingen. De burrhole is 2.3mm aan de rechterkant van de bregma door langzaam te draaien een 16 gauge 1 ½ inch naald met een kleine hoeveelheid van de druk tot de schedel is doorgedrongen en de hersenen is blootgesteld. Figuur 3. Een kinetische vergelijking van de subcutane (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "alt =" Figure3.1 "/>) versus intraperitoneale ( ) Luciferine injectie werd uitgevoerd om het nut van een subcutane injectie luciferine te tonen en om de optimale tijd te identificeren om de afbeelding na luciferine administratie. Drie minuten na de luciferine werd geïnjecteerd met de muis was verdoofd, geplaatst in de IVIS Spectrum instrument en elke 3 minuten belicht voor maximaal een uur en iedere 6 minuten na dat om een kinetische curve van bioluminescentie te genereren. Dit toonde aan dat een subcutane route van luciferine administratie was superieur aan een intraperitoneale injectie in onze handen, en dat de optimale tijd om het imago van de dieren was ongeveer 25 minuten na de luciferine injectie wanneer GL261-luc-cellen werden gebruikt. Figuur 4. Meerdere weergaven van een 3-Dimensionale reconstherrie van de intracraniale implantatie van GL261-luc2 cellen co-ingeschreven bij de muis skelet en de hersenen. Figuur 5. Photon tellingen verkregen van tumoren als gevolg van GL261-luc cellen vs GL261-luc2 cellen. De resultaten zijn een gemiddelde van 5 dieren. Figuur 6. Grafiek van GL261-luc tumorcelgroei in een albino C57BL / 6 muis. Bioluminescentie werd gemeten om de 3 dagen en uitgezet als in vivo foton tellen versus dagen na implantatie. Foto's tonen bioluminescentie op verschillende tijdstippen. Kleur is een indicatie van bioluminescentie (pixel intensiteit), die is in verhouding tot het aantal tumorcellen (kleur balk wordt getoond aan de rechterkant). Nadat het dier bezweek aan de ziekte van de hersenen werd ontleed en luciferine werd plaatselijk toegevoegd aan de ex vivo IMAG te verkrijgene in de figuur inzet.
