בעקבות Cell-גורל ב<em> א coli</em> לאחר זיהום על ידי phage מבדה

1. יצירת lysate phage הגולמי (איור 1) בבקבוק מ"ל 50, לחסן מושבה טריה של LE392 (λ LZ1) [pPLate * D] (ראה טבלת מס '1 לפרטים נוספים) ל6 מ"ל של מדיום LB 7 בתוספת עם 10 מיקרוגרם / המ"ל Kanamycin ו100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין. לגדול בין הלילה של 30 ° C עם רעד קל (180 סל"ד). דלל את 1:100 התרבות לLBM (LB בתוספת 10 mM MgSO 4) וגדל ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד קל (180 סל"ד). על מנת לייעל את תשואת phage, לוודא שנפח התרבות הוא לא יותר מעשירית מקיבולת נפח הבקבוק. אנחנו בדרך כלל להכין שתי צלוחיות של קיבולת 2 ליטר או 2.5 ליטר, ולהוסיף תרבות הלילה 2.5 מ"ל למדיום LBM 250 מ"ל בכל בקבוק. כאשר צפיפות התאים מגיעה OD 600 ≈ 0.6 (~ 2.5-3 שעות), לגרום lysogen ידי הזזת התרבות ל42 ° C מים באמבטיה שייקר ל18 דקות עם רעד קל (180 סל"ד), ולאחר מכן incubatדואר על 37 מעלות צלזיוס עם רעד קל (180 סל"ד) עד תמוגה גלויה (התרבות הופכת להיות ברורה, ב~ 60-90 דקות). הוסף כלורופורם 2% לתרבות, לנער ביד לערבב, ואז דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: ללבוש כפפות כדי לטפל בכלורופורם, ולהימנע מלנשום אותו. העברת התרבות לשני בקבוקים 250 מ"ל צנטריפוגות, סרכזת התרבות בSorvall GSA הרוטור ב10000 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 ° C. שחזר את supernatant המכיל את חלקיקי phage, והשלך את הגלולה של פסולת. בצע צנטריפוגה שנית, כדי לוודא כדי להיפטר מהפסולת הגלויה. השתמש פרוטוקול טיטרציה phage סטנדרטי 8 כדי למדוד את ריכוז פאג. כייל phage צריך להיות 5-10 ~ x 10 9 pfu / מ"ל. השתמש מתח supF כגון LE392 כמחוון המתח בגלל Sam7 המוטציה בגנוטיפ של פאג הניאון, ולהשתמש בחלק עליון ואגרו צלחות אגרו עשה עם NZYM העשיר להשיג הפלאק גדול יותר (Figure 2). 2. טיהור phage (איור 1) יוצקים לתוך lysate בקבוק גדול (לדוגמה: 2-ליטר), להוסיף DNase אני וRNase (מיקרוגרם 1 / מ"ל ​​כל אחד) לlysate כדי לעכל את החומצות המשוחררות מחיידקי lysed הגרעין, ודגירת 1 שעה בטמפרטורת חדר. הוסף NaCl 1M לlysate, להעביר lysate לבקבוקי 250 מ"ל צנטריפוגות, ודגירה 3 שעות על קרח. צנטריפוגה lysate בSorvall GSA ב 10,000 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 ° C. שחזר את supernatant. כייל phage צריך להיות דומה לזה של lysate הגולמי, שהוא ~ 5-10 x 10 9 pfu / מ"ל. התוספת של NaCl מקדמת ניתוק של חלקיקי phage מפסולת חיידקים, ודורש למשקעים יעילים של חלקיקי phage ידי PEG 8. יוצק לתוך lysate בקבוק גדול, למשל בקבוק 2-ליטר, להוסיף 10% (w / v) PEG8000 לlysate, מערבבים לאט או לנער לפזר PEG8000 בטמפרטורת חדר. העברת lysate לסנאט 250 מ"לבקבוקי rifuge ואז דגירת הלילה (~ 16 שעות) ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate בSorvall GSA הרוטור ב 10,000 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 ° C. השלך את supernatant. משרה את הגלולה (חלקיקי phage זרזו עם PEG8000) עם phage SM חיץ (4 חיץ SM מ"ל ל250 מ"ל של lysate phage הראשוני). דגירה עם רעד קל או מאוד לא רועד עבור 16 שעות ב 4 ° C. מוציא בעדינות lysate (חיץ SM עם חלקיקי phage) לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל אפנדורף, ולאחר מכן לשטוף את הגלולה שנותרה עם 0.5 – 1 מ"ל של חיץ SM. הוסף נפח שווה של כלורופורם לlysate. בעדינות מערבב את lysate עם כלורופורם על ידי עד היפוך ושוב כמה פעמים. צנטריפוגה ב 4000 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 ° C באפנדורף 5804R או צנטריפוגה דומה עליונת ספסל. חזור על שלב 2.6 כדי לקבל lysate ברור יותר. כייל phage צריך להיות 1-2 ~ x 10 11 pfu / מ"ל. הכן את פתרוני SM / CsCl עם שלוש צפיפויות שונות (ρ) של 1.3 גר '/ מ"ל, 1.5 גרם / מ"ל ​​ו 1.7 גר '/ מ"ל. למדוד את מקדם השבירה (η) כדי לקבל קריאה מדויקת יותר צפיפות. המרת הצפיפות 9 היא ρ = 10.8601 η – 13.4974 ב 25 ° C. ראה טבלה 3 לקבלת פרטים. השתמש במזרק עם מחט ארוכה כדי לטעון את הפתרון לתוך צינור 14 מיליליטר אולטרה ברור קמן 40Ti ultracentrifuge. כדי להימנע מערבוב כדי ליצור שיפוע צפיפות טובה יותר, underlaying הפתרון (פתרונות כלומר שכבות של צפיפות גוברת תחת אחד אחר) צריך להיות בשימוש, כלומר, בעדינות לטעון 2 מ"ל של פתרוני SM / CsCl בצו של 1.3 גר '/ מ"ל, 1.5 גרם / מ"ל ​​ו -1.7 ג'/ מ"ל ​​על ידי החדרת המחט עם מזרק 3 מ"ל לתחתית של התחתית. עדינות לטעון 8 מ"ל של lysate phage ידי כיסה מהחלק העליון של צינור ultracentrifuge 14 מ"ל. הכן את צינור איזון. צנטריפוגה בקמן SW40Ti הרוטור ב24000 סל"ד במשך 4 שעות ב 4 ° C. מוציא בעדינות את הצינור בחדר חשוך ולהאיר מהחלק העליון של הצינור על רקע שחור באמצעות aflashlight. להקת phage צריכה להיות נראית בבירור במיקומו של הממשק בין 1.3 גר '/ מ"ל ו -1.5 שכבות גרמו / מיליליטר SM / CsCl (איור 3 א). לנקב בצד של הצינור מעט מתחת ללהקה עם מחט 21.5 מד עם מזרק 3 מ"ל. עדינות לאסוף ~ 500 μl של השעית פאג. כייל phage צריך להיות 5-10 ~ x 10 11 pfu / מ"ל. הנח את השעית phage לתוך צינור 4 מיליליטר אולטרה ברור קמן ultracentrifuge SW60Ti הרוטור. מלא את הצינור עם 1.5 גר '/ מיליליטר SM / פתרון CsCl. הכן את צינור איזון. צנטריפוגה בקמן SW60Ti הרוטור ב35000 סל"ד במשך 24 שעות ב 4 ° C. חזור על אותו התהליך כמו בשלב 2.11 לאסוף phage מהלהקה הגלויה. הלהקה צריכה להיות גלויה כפי שמוצג באיור 3 ב. טען השעית phage לתוך קלטת קרום דיאליזה (טבלה 2) ודיאליזה שלוש פעמים נגד נפח 1000-קיפול של חיץ SM ב 4 מעלות צלזיוס במשך תקופות של 3 שעות, 3 שעות וovernigHT (~ 16 שעות). מטרת הדיאליזה היא להיפטר מהווה CsCl בהשעית פאג. כייל phage הסופי צריך להיות ~ 5-10 x 10 11 pfu / מ"ל. 3. הכן לוח 1 agarose ג'ל (איור 4) נקה 6 שקופיות מיקרוסקופ (75 מ"מ x 50, עובי 1 מ"מ) עם אתנול 70%. סדר 5 מגלשות ולאבטח עם קלטת כפי שמוצג באיור 4. מערבב 0.09 גרם agarose לתוך מדיום 6 מ"ל בכוס קטנה מכוסית בפלסטיק נצמד (מניב 1.5% agarose). מחמם על כיריים עד שהתמיסה הופכת ברורה. יוצק את פתרון agarose על גבי השקופיות המאובטחות. הנח את השקופית האחרונה על העליונה, הימנעות בועות אוויר בזהירות. מקום על גבי משקל ולאפשר להתקרר במשך ~ 30 דקות. הסר את 4 שקופיות בצד, ולעטוף את הגוש יחד עם שקופיות העליונות ותחתונות עם פלסטיק נצמד. הלוח ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים. 4. בדיקת מלאי phage המטוהר להכיןלוח PBS-agarose ג'ל כפי שתואר לעיל (סעיף 3). כתם phage המטוהר עם DAPI. מערבב 10 μl של פאג (~ 1 x 10 10 pfu / מ"ל) עם 10 μl של 10 מיקרוגרם / המ"ל DAPI (ריכוז DAPI סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C או 10 דקות בטמפרטורת חדר. μl מקום 1 של תערובת phage / DAPI במרכז 24 מס '1 x 50 המ"מימ coverslip, כיסוי חתיכה קטנה (~ 10 x 10 מ"מ) של הלוח המוכן מראש PBS-agarose. הפיסה הקטנה של לוח agarose היא לחתוך בסכין גילוח לאחר השקופית העליונה בג'ל הכריך מוסר. תמונת המדגם תחת מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות ערוצי YFP וDAPI. פאגים בודדים צריכים להיות גלויים כמו "כתמים" עקיף מוגבלי ניאון בשני הערוצים (איור 5). השתמש באותו מיקרוסקופ וsetups מצלמה כמו בשלב 6.2 להלן. 5. זיהום (איור 6) בצינור 14 מ"ל פלקון, לחסן מושבה טריה של LE392 [PP RE-MCHerry] (ראה טבלת מס '1 לפרטים נוספים) לתוך 2 מ"ל של מדיום LB בתוספת 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין, 10 המ"מ 4 MgSO 0.2% ומלטוז. לגדול בין הלילה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד בגוף בינוני (265 סל"ד). דלל 1:1000 התרבות לLBMM (LB בתוספת 10 mM MgSO 4 ו 0.2% מלטוז), כלומר להוסיף תרבות הלילה 5 μl למדיום LBMM 5 מ"ל בבקבוק ml 50. לגדול ל OD 600 ≈ 0.4 על 37 מעלות צלזיוס עם רעד בגוף בינוני (265 סל"ד). השתמש בינוני LBM להכין לוח ג'ל LBM-agarose כמפורט בסעיף 3 לעיל. צנטריפוגה 1 מ"ל של תאים ב2000 גרמו בmicrocentrifuge עליון ספסל עבור 2 דקות בטמפרטורת חדר. הסירו את supernatant, ועדינות resuspend התאים ל20 LBMM μl קר כקרח כדי להגיע OD 600 & 20. מתי לטפל בסחורת phage המטוהרת, להשתמש קצה פיפטה רחב או לחתוך את קצה פיפטה רגיל לעשות את קצה פתיחה רחב יותר, כדי למנוע הטית חלקיקי phage 3. עדינות Mix 20 μl של תאים עם 20 μl מטוהר phage להגיע יחס פאגים לתא ממוצע בטווח של 0.1 – 5. לדגור על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר phage ספיחה, ולאחר מכן מדגיר ° C אמבט מים 35 למשך 5 דקות כדי לעורר הזרקת דנ"א phage 6. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים להפריד כל אגרגטים סלולריים. שוב להשתמש קצה פיפטה רחבה כדי למנוע את גזירת פאגים. דלל את התערובת לתוך 1:10 LBMM, למשל תערובת μl 5 לLBMM μl 45. מניח חתיכת לוח LBM-agarose (~ 10 x 10 מ"מ) על coverslip מס '1 22 x 22 מ"מ. הלוח המוכן מראש LBM-agarose צריך להיות ממוקם בטמפרטורת חדר למשך שעה לפחות 1 לפני שימוש על מנת להבטיח כי לוח agarose מגיע לטמפרטורת חדר. μl המקום 1 של תערובת phage / תא בלוח agarose ולחכות לדקות 1 כדי לאפשר לתערובת לספוג לתוך לוח agarose. מניח בעדינות 24 מס '1 x 50 מ"מ coverslip בחלק העליון של לוח agarose. הליך זה נועד למנוע הטיה על פאגים מinfתא ected (איור 6). 6. בעקבות גורל תא מתחת למיקרוסקופ זהירות הר coverslip על הבמה של מיקרוסקופ. עבור הדמיה, השתמש-הגדלה גבוהה (למשל 100x) אובייקטיבית (ראה מערכת מיקרוסקופ בדיון להלן). לרכוש תמונה מוגדרת למסגרת הזמן הראשונית. סט תמונה זו משמשת כדי לאפיין את המספרים ועמדות הראשוניים של כל פאגים המדביק. קח סדרה של 15 תמונות במרווחי 200 ננומטר Z-ציר (אנכי). תמונה דרך ערוץ YFP. בנוסף, לקחת תמונה אחת בפוקוס בשלב הניגוד וערוצי mCherry. לייעל את עוצמת האור ומשך חשיפה לקבלת אות חזקה מספיק תוך מזעור הלבנה וניזק לתאים (ראה יבוא תמונות בדיון להלן). לרכוש סרט זמן לשגות של גורל התא לאחר פגיעה. תמונת המדגם בשלב לעומת זאת, YFP וmCherryערוצים במרווחי זמן של 10 דקות לשעות סביב 4. במהלך סרט זמן לשגות, השתמש תמונה אחת Z-עמדה לכל ערוץ לכל נקודת זמן, כדי להימנע מחשיפה מיותרת של המדגם, אשר עלול להוביל להלבנה וphototoxicity. 7. ניתוח תמונה ידני לספור את מספר פאגים ומיקום השיא phage ואורך התא במסגרת הזמן הראשונית. ניתן לעשות זאת באמצעות תוכנה כמו MetaMorph או ImageJ. הקלט את גורל התא (ממוסס, lysogenic או נגוע), זמן תמוגה, וכל מידע מבוקש אחר על ידי משחק בסרט זמן לשגות. כדי לזהות גורל תאים שונים, לראות סרט זמן לשגות בסעיף תוצאות נציג בהמשך. בנוסף לניתוח הידני לעיל, מידע כמוני יותר (למשל רמת פלואורסצנטי לאורך זמן בתאים בודדים) ניתן לחלץ באמצעות אלגוריתמי תא לזיהוי ומעקב אוטומטיים שושלת. אנו משתמשים בתכנת Matlab בית שנבנה עבור tracing המשפחה של תאים ורמות קרינה, יחד עם קוד Schnitzcell Matlab לפילוח תא (שנכתב על ידי קבוצת Elowitz בקלטק). 8. תוצאות נציג: ציפוי phage: את הפלאק של פאגים כותרתו fluorescently (ב -1.6 צעד וסעיף 2) הוא קטן משמעותי מאלה של זן בר (איור 2). לפיכך, אנו מדגירים את הצלחות לפחות 12 שעות ב37 מעלות צלזיוס החממה לפלאק תהיה גלויה. Ultracentrifugation phage: לאחר ultracentrifugation של מדגם phage עם שיפוע צעד CsCl (שלב 2.10), שתי להקות צריכות להיות גלויות (איור 3 א). הלהקה העליונה, בממשק שבין השעית phage ושכבת SM / CsCl 1.3 גרם / מ"ל, מכילה פסולת תא וcapsids phage הריק. הלהקה התחתונה, בממשק שבין SM / CsCl 1.3 גרם / מ"ל ​​ו -1.5 שכבות גרמו / מ"ל, היא להקת פאג. תיהלהקה של ירקרקה מופיעה לphage λ LZ2 הניאון. הלהקה הפרועה הסוג פאג λ IG2903 מופיעה כחלחלה 5. לאחר ultracentrifugation של שיפוע שיווי המשקל CsCl בשלב 2.12, להקת phage אחד צריכה להיות גלויה בחלק האמצעי של הצינור (איור 3 ב '). מאז phage λ ניאון LZ2 מכיל תערובת של GPD-EYFP וGPD capsids, היחס של חלבון לדנ"א הוא גבוה מזה של זן בר. לכן, הלהקה של ניאון phage λ LZ2 היא מעט קלה יותר (נראה כי במיקום גבוה יותר בצינור) מזו של סוג הפראי λ IG290310. כתמי DAPI: איור 5 מראה תמונות אופייניות המתקבלות לאחר תיוג phage עם DAPI (סעיף 4). אותות YFP וDAPI של פאג מטוהר בהצלחה צריכים קרוב ל 100% התכתבות. אנחנו בדרך כלל לצפות כי פחות מ 1% מנקודת YFPזה אינו מכיל DAPI (המייצג capsids ללא הגנום הנגיפי). פחות מ 1% מנקודתי DAPI אינם מכילים YFP (מתאים לפאגים שאינם ניאון) 5. סרט זמן לשגות: תאי ממוסס מוכרים על ידי ההצטברות של YFP פלואורסצנטי (ערוץ ירוק) בתוך התא, ואחרי תמוגה תא. תאי Lysogenic מוכרים על ידי ההצטברות של מדי mCherry פלואורסצנטי (אדום) בתוך התא וחידוש צמיחת תאים נורמלים וחילוק. תאים נגועים (או תאים שבו הזיהום נכשל) לא יציגו כל אחד מהפנוטיפים הנ"ל וגדל ומתחלקים באופן נורמלי. איור 7 מראה כמה סטים-תמונה של שלב לעומת זאת, ערוצי mCherry, ואת התמונות המעולפות המקבילות של אלה וYFP שלושה ערוצים, מסרט הזמן לשגות טיפוסי (סעיף 6). את פאגים הבודדים (נקודות ירוקות) הם נראים בבירור במסגרת הזמן הראשוני (סעיף 7 איור). בדרך כלל, מספרשל פאגים נראים על פני התא (כנראה להדביק התאים האלה) ואילו פאגים אחרים unadsorbed, כפי שמוצגים באיור 7 ב (פנל שמאלי). תוצאת הזיהום הופכת להבחין לאורך זמן. מחזור ממוסס מצוין על ידי ייצור התאי של פאגים חדשים (ירוק, איור 7 ג) ואחרי תמוגה תא (תאים שהתפוצץ עם פאגים ירוקים משוחררים, האיור 7D). Lysogeny מצוין על ידי הייצור של mCherry מאמרגן P רי (אדום, איור 7 ג) ואת חידוש צמיחת תאים וחטיבה (אדום, האיור 7D). איור 1. </strאונג> תרשים זרימה המתאר את יצירתו של פאגים ניאון. Lysate phage גולמי הושג לראשונה על ידי גרימת lysogen של GPD-EYFP phage, מחסה פלסמיד להביע פראי סוג GPD חלבון (הפנלים א.ב.). Phage מטוהר באמצעות סדרה של צעדים (CL פנלים). איור 2. הפלאק phage. לוחות של פאג הניאון (משמאל) קטנים מאלה של זן בר (מימין) לאחר דגירת צלחות עבור 12 שעות ב 37 ° C. איור 3. להקות phage לאחר ultracentrifugation. א) שתי להקות גלויים לאחר ultracentrifugation בשיפוע צעד CsCl. 1 העליון מתאים לפסולת תא וcapsids phage הריק; הלהקה התחתונה מכילה phage הרצוי. משמאל: phage ניאון, ימין:. סוג B פראי ) להקת phage אחת גלויה לאחר ultracentrifugation בשיפוע שיווי משקל CsCl. להקת phage הניאון (משמאל) היא ירקרקה, בהשוואה ללהקה כחלחלה לphage סוג הפרוע (מימין). איור 4. ההליך של הכנת לוחות ג'ל agarose. איור 5. תמונות של פלורסנט פאגים לאחר צביעת DAPI. פאגים בודדים הם להבחין בקלות, וYFP וDAPI מאותת שיתוף לוקליזציה טובה מאוד. איור 6. תיאור סכמטי של זיהום phage והתקנת הדמיה. לחץ כאן לצפייה בגרסה בגודל מלא של תמונה זו. gure 7 "src =" / files/ftp_upload/3363/3363fig7.jpg "/> איור 7. תמונות אופייניות מסרט הזמן לשגות של זיהום פאג. הראה הם השלב לעומת זאת, ערוצי mCherry, כמו גם כיסוי של השלושה הערוצים YFP ו. (A) תמונות YFP ערוצים ממסגרת הזמן הראשונית. שמאל, בסכום של תמונות YFP ב- z עמדות שונות. השלוש התמונות הנכונות הן תמונות YFP מדגם ב-z עמדות שונות, המתאימים לאזורים שונים על פני התא. (ב), (ג) ו (ד ') תמונות מעולף (משמאל) של שלב הניגוד (באמצע שמאל), ערוצי YFP (אמצע ימין) וmCherry (מימין) בטווחי זמן שונים. (ב) בt = 0, שני תאים נראים, כל אחד הנגוע בphage בודד (נקודות ירוקות), ותא אחד נגוע על ידי 3 פאגים. נצפו גם כמה פאגים unadsorbed. (ג) בt = 80 דקות, שני התאים שנדבקו ב פאגים בודדים, כל אחד נכנסו למסלול ממוסס, כפי שמעידד על ידי הייצור התאי של פאגים חדשים (ירוק). התא הנגוע ב3 פאגים הושקע מסלול lysogenic, כפי שצוין על ידי הייצור של mCherry מאמרגן PRE (אדום). (ד) בt = 2 שעות, מסלול ממוסס הביא תמוגה תא (תא התפוצץ), ואילו תא lysogenic חלק §. § פנלים השמאליים של איור 7 (ג) (ד) הם שהודפס מתא, 141, Lanying זנג, סמואל א 'סקינר, Chenghang זונג, ז'אן עם קש, מיכאל Feiss, ועידו גולדינג, קבלת החלטות ברמת subcellular מקובע את התוצאה של זיהום bacteriophage, 682-691, זכויות יוצרים (2010), באישור Elsevier. מסנן שם גנוטיפ הרלוונטי מקור / התייחסות זני חיידקים LE392 supF ג'ון Cronan, אוניברסיטת אילינוי זני phage λ LZ1 GPD-EYFP, D-eyfp cI857 Sam7 ב :: kanR זנג et al. 5 λ LZ2 GPD-פסיפס, אותו גנוטיפ כλ LZ1 זנג et al. 5 פלסמידים PP רי – mCherry mCherry תחת השליטה של P רי, המגבר R זנג et al. 5 pPLate * D GPD תחת השליטה של אמרגן מאוחר λ, המגבר R זנג et al. 5 טבלת 1. זני חיידקים,פאגים ופלסמידים משמשים בעבודה זו. ρ צפיפות (גרם / מ"ל) CsCl (ז) SM (מ"ל) השביר η 1.30 39 86 1.3625 1.50 67 82 1.3815 1.70 95 75 1.3990 לוח 3. פתרוני CsCl ערוך SM חיץ (100 מ"ל) לשיפועי צעד.