بعد الخلوي في مصير<em> E. القولونية</em> بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية
Summary
توضح هذه المقالة الإجراء لإعداد الإصدار fluorescently التي تحمل علامات لامدا عاثية، والعدوى من<em> E. القولونية</em> البكتيريا والعدوى بعد ظهور نتائج تحت المجهر، وتحليل النتائج العدوى.
Abstract
نظام يتألف من الجراثيم (بالعاثية) امدا والبكتيريا E. وقد خدم القولونية طويلة كنموذج ل1،2 تقرير مصير الخلية. بعد العدوى المتزامنة للخلية بها عدد من فاجات، يتم اختيار واحد من مسارين: التحللي (ضراوة) أو مستذيب (نائمة) 3،4. ونحن وضعت مؤخرا طريقة لوصفها fluorescently فاجات الفردية، وكانوا قادرين على دراسة قرار ما بعد الإصابة في الوقت الحقيقي تحت المجهر، على مستوى الفرد وفاجات الخلايا 5. هنا، نحن تصف الإجراء الكامل لأداء التجارب العدوى الوارد وصفها في وقت سابق عملنا 5. وهذا يشمل إنشاء فاجات الفلورسنت، والعدوى من الخلايا، والتصوير تحت المجهر وتحليل البيانات. فإن الفيروس هو الفلورسنت قوة "مختلطة"، وشارك في التعبير عن الإصدارات من النوع البري وYFP الانصهار من البروتين قفيصة GPD. يتم الحصول أولا المحللة بالعاثية الخام عن طريق حفز على مستذيب من (GPD-EYFP ENHanced صفراء نيون البروتين) بالعاثية، معربا عن إيواء والبرية البلازميد نوع GPD. ثم يتم تنفيذ سلسلة من الخطوات لتنقية، تليها دابي وضع العلامات والتصوير تحت المجهر. يتم ذلك من أجل التحقق من التوحيد، DNA الكفاءة التعبئة والتغليف، إشارة مضان والاستقرار الهيكلي للسهم بالعاثية. يتم تنفيذ الأولي لامتصاص فاجات للبكتيريا على الجليد، ثم تليها على حضانة قصيرة في 35 ° C لتحريك الفيروسية حقن DNA 6. ثم يتم نقل فإن الفيروس / خليط البكتيريا على سطح لوح المغذيات آجار رقيقة، مع تغطية ساترة وتصوير تحت المجهر epifluorescence. ويتبع عملية ما بعد الإصابة لمدة 4 ساعة، 10 دقيقة على فترات. يتم تعقب مرحلة مواقف متعددة مثل التي يمكن أن تعزى ~ التهابات الخلايا 100 في تجربة واحدة. في كل نقطة موقف والوقت، يتم الحصول على الصور في المقابل مراحل وقنوات الفلورسنت الأحمر والأخضر. يتم استخدام الصور على النقيض من المرحلة في وقت لاحق لسل الآليالاعتراف لتر في حين يتم استخدام القنوات الفلورسنت لوصف نتائج العدوى: إنتاج فاجات الفلورسنت الجديدة (الخضراء)، يليه تحلل الخلايا، أو التعبير عن العوامل استذابة (أحمر)، يليه نمو الخلايا المستأنفة والانقسام. تتم معالجة المكتسبة الوقت الفاصل بين الأفلام باستخدام مزيج من الأساليب اليدوية والآلية. نتائج تحليل البيانات في تحديد مؤشرات الإصابة لكل حدث العدوى (مثل عدد ومواقف اصابة فاجات)، وكذلك نتيجة العدوى (تحلل / استذابة). ويمكن استخراج معلمات إضافية إذا لزم الأمر.
Protocol
Discussion
سلالات بكتيرية، وبالعاثية البلازميدات:
سلالة LE392 هو supF. تم اختيارها لقمع طفرة في الجينوم Sam7 بالعاثية (انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل). وهكذا، سوف يتسبب lysogens ليز والافراج عن الجسيمات في نهاية المطاف بالعاثية، وكذلك الخلايا المصابة التي اختارت المسار التحللي. تزرع الخلايا مستذيب في 30 ° C بسبب وجود درجة حرارة 857 CI الحساسة أليل في الجينوم بالعاثية. بعد تحريض الحرارة، وGPD-EYFP والبرية GPD نوع من شارك في أعربت جينوم LZ1 λ وpPlate البلازميد * D على التوالي. ونتيجة لذلك، قفيصة من LZ2 تم إنشاؤه حديثا λ بالعاثية يحتوي على خليط من GPD-EYFP والبروتينات GPD. هذه الفسيفساء بالعاثية مستقرة هيكليا والفلورسنت بما فيه الكفاية للسماح الكشف عن فاجات الفردية 5. RE PP – mCherry هو مراسل البلازميد المستخدمة للكشف عن اختيار pathwa مستذيبذ. يتم تنشيط RE P المروج من خلال CII إنشاء استذابة 1،11. وقد اشتق mCherry 5 من PE-GFP 11 من استبدال GFP مع mCherry 12 – PP RE. لمزيد من التفاصيل انظر عملنا في وقت سابق 5.
معلمات نمو الحالة:
خلال الحث مستذيب (القسم 1)، الهز الخفيف عند 180 دورة في الدقيقة يعطي غلة جيدة الفيروس 13. استخدام الجلوكوز في المتوسط النمو كما يجب تجنب المنتجات يولد ايض الجلوكوز الأيض الحمضية، والجزيئات غير مستقرة ناضجة لامدا في الرقم الهيدروجيني الحمضية 13. وتهدف إضافة MgSO 4 في استقرار بالعاثية قفيصة 3. لفاجات تحمل البرية اخ نوع (بي بدلا من 857)، ويمكن أن يتسبب في مستذيب باستخدام C DNA المضرة ميتوميسين كيل 3. في الخطوة 1.3، والحضانة عند 37 ° C ينبغي عادة لا تتجاوز 90 دقيقة. فمن usef UL للتحقق من كثافة الخلايا بواسطة OD 600 كل 30 دقيقة. لالمحللة جيدة، OD 600 ينخفض إلى نحو 0.2 أو أقل، وOD المتبقية 600 هو نتيجة للحطام الخلايا. قد تفرخ طويل جدا يؤدي إلى انخفاض العائد بالعاثية منذ بالعاثية تم إنشاؤه حديثا قد تبدأ في ضخ عينات من الحمض النووي في الخلية الحطام. للحصول على الفرقة بالعاثية مرئية (على الأقل 1 × 10 الجسيمات بالعاثية 11) في خطوات 2.11 و 2.13، وتنمو على الأقل 500 مل الثقافة في الخطوة 1.2. وتهدف إضافة مالتوس 0.2٪ في المتوسط في خطوات النمو 5.1 و 5.2 في التعبير حمل من لحم الضأن، ومستقبلات لامدا بالعاثية الامتزاز 3،14. ويهدف التخفيف 1000-أضعاف أضعاف بدلا من-100 في الخطوة 5.2 في خفض مستوى الخلفية mCherry من RE مراسل بي بي البلازميد – mCherry. في الخطوة 5.5 لحقن الحمض النووي مما اثار بالعاثية، 35 ° C يتم اختيار لتجنب تحريض على أليل حساسة للحرارة cI857.
بالعاثية تنقية:
jove_content "> يمكن استبدال الخطوات تنقية بالعاثية (2،1 خطوات من خلال 2.11) مع بروتوكولات أخرى تنقية 5، ولكن من خلال التدرج تنبيذ فائق النهائي التوازن CSCL (2.12 و خطوات 2.13) أمر لا مفر منه. دوارات الدلو المتأرجح هناك حاجة في خطوات 2.10 و 2.12 ل ضمان حادة العصابات بالعاثية مرئية. الحصول على الأسهم النقية بالعاثية يمكن أن تتخذ بسهولة تصل إلى أسبوع، ولذلك فمن الضروري التحقق من عيار بالعاثية على طول الطريق لتأكد من أي شيء يذهب على نحو خاطئ خلال خطوات وسيطة.بالعاثية يعالج:
خلال جميع الإجراءات تنقية في القسم 2، من المهم جدا للتعامل مع بالعاثية حلالة بلطف لتجنب قص ذيول بالعاثية من رؤساء بالعاثية. خلال العدوى خلية في القسم 5 (على سبيل المثال، من خلال خطوات 5،5 5.7)، كما أنها ضرورية لتجنب القص من الجسيمات بالعاثية من الخلية المصابة. ملاحظة أنه إذا تم المنفصمة فإن الفيروس من الخلية المصابة بعد حقن الحمض النووي، والنتيجة هي "الظلام" عدوى، أي فيوسيراعى في نتائج التجربة في fection لكن بالعاثية اصابة لن. للحد من هذه المشاكل، ونحن نستخدم تلميح ماصة واسعة كلما التعامل مع فاجات أو الخليط بالعاثية / خلية.
دابي الاختبار:
تلطيخ السهم بالعاثية مع دابي (القسم 4) هو وسيلة سريعة وفعالة للتحقق من نقاء الأسهم بالعاثية. ويمكن أيضا أن تستخدم لاختبار إمكانية تدهور مخزون بالعاثية القائمة مع مرور الوقت. لسهم نقي، ينبغي أن يشترك في توطين إشارات YFP ودابي تحت المجهر مضان تكون قريبة من 100٪. نلاحظ عادة أن أقل من 1٪ من البقع YFP لا تحتوي على دابي (تمثل capsids دون الجينوم الفيروسي)، مما يدل على أن هذه الجسيمات لم حزم بنجاح الحمض النووي الفيروسي أو قد حقن الحمض النووي بالفعل في أماكن أخرى. أقل من 1٪ من البقع دابي لا تحتوي على YFP (الموافق غير الفلورسنت فاجات). إذا لم تكن هذه هي الحالة، من خلال خطوات 2،12 2،14 حاجة للتكرار في سrder لتنقية مرة أخرى. فيما يتعلق المعلمات والتصوير، والإعداد المجهر في الخطوة 4.3 ليست حرجة كما هو الحال في المادة 5 لأنه لا يلزم على المدى الطويل الخلية الحية التصوير هنا. ومع ذلك، والحفاظ على إعدادات الفحص المجهري نفسه كما في القسم 5 من المفيد إذا كان أحد يرغب لمعايرة كثافة مضان من الجسيمات بالعاثية واحد. إذا كان لوح PBS-الاغاروز ليست نظيفة جدا، أو الكثير من يستخدم صبغة دابي، قد يكون محاطا بعض المواقع دابي الموافق DNA بالعاثية مع "هالة". إذا تم استخدام القليل جدا دابي صبغة، قد الإشارة من قناة دابي تكون ضعيفة جدا.
المجهر النظام:
للتصوير في القسم 6، ونحن نستخدم المجهر تجاري epifluorescence مقلوب (الكسوف TE2000-E، نيكون) مع هدف 100X (خطة فلوو، والفتحة العددية 1.40 في الغمر النفط) ومجموعات التصفية القياسية (نيكون). مصدر الضوء مضان هو مصباح القوس مع السيطرة على شدة الضوء. الميزات التالية يتم التحكم الكمبيوتر: X، Y Z وبوsition؛ حقل مشرق ومصاريع مضان، واختيار مرشح مضان. مطلوب ميزة التركيز التلقائي. وإلا، قد تنجرف بسهولة التركيز بعيدا خلال الوقت الفاصل بين الفيلم (عادة 4 ساعات طويلة). القدرة على الحصول على وظائف متعددة (س، ص) في كل نقطة زمنية مفيد، لأنه يتيح لمتابعة الأحداث العدوى متعددة في نفس الوقت. نكتسب عادة مناصب المرحلة 8 في كل فيلم، ومتابعة للأحداث العدوى 100. الكاميرا التي نستخدمها هي 512×512 تبريد CCD مع 16X16 بيكسل ميكرومتر مع مجموعة ديناميكية من 16 بت (Cascade512، Photometrics). يتم تنفيذ برامج اقتناء باستخدام MetaMorph (الأجهزة الجزيئية). يجب وضع المجهر في غرفة التحكم في درجة حرارته؛ بدلا من ذلك، ينبغي أن تكون محاطة المرحلة المجهر من قبل غرفة التحكم في درجة حرارته.
الصورة اكتساب:
لحية خلايا التصوير، فمن الأهمية بمكان لتجنب التعرض غير الضروري للعينة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تبيض وبوtotoxicity. ولذلك، فمن الأفضل لوصف أول نظام لإيجاد التعرض للضوء الأمثل الذي يسمح للكشف مضان في حين لا تؤدي إلى نمو الخلايا المفرط أو تبيض معرقلة. للحصول على صورة جيدة مضان، ولعب مع شدة الضوء مثيرة، وزيادة زمن التعرض الكاميرا. في خطوات 6،2-6،3، يتم اختيار الإطار الزمني 10 دقيقة لغرض التقليل من التعرض للضوء. في كل إطار، لا بد من واحد فقط في التركيز على عكس صورة المرحلة (للاعتراف الخلية) وقنوات الفلورسنت (لتحديد مصير الخلية). في نقطة أول مرة، يطلب ومع ذلك، متعددة Z-موقف الصور من خلال برنامج قناة YFP لالتقاط جميع فاجات اصابة على سطح الخلية. قد زمن التعرض YFP في الإطار الأولي بحاجة أيضا إلى أن تكون أعلى من تلك المستخدمة للفيلم في الوقت الفاصل بين الأطر وقت لاحق.
تحليل الصور:
بعناية شديدة الاعتماد الجسيمات بالعاثية حول سطح الخلية في الخطوة 7.1. كماالمشار إليها أعلاه، ونحن نأخذ سلسلة من المداخن Z-من خلال قناة YFP في الخطوة 6.2. ولكن هذا قد لا تزال تترك بعض الجزيئات بالعاثية الفلورسنت خارج التركيز، التي تتحدى العد. يتم قياس طول الخلية في الإطار الزمني الأولي باستخدام برنامج Metamorph. ويمكن أيضا طول الخلية تقاس يماغيج أو أدوات البرمجيات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للبرنامج الآلي المنزل مطلب بني أن تكون مفيدة جدا في الحصول على معلومات مثل تغير مضان مع مرور الوقت على طول الأنساب الخلية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لمايكل فايس وجان سيبي لتوجيهات بشأن إنشاء بالعاثية وتنقيتها. نشكر مايكل Elowitz لتوفير برنامج التعرف على الخلية، Schnitzcell. ويدعم عمل في المختبر غولدنغ من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM082837)، المؤسسة الوطنية للعلوم (082265، PFC: مركز للفيزياء الخلايا الحية)، ومؤسسة ولش (المنح Q-1759) وعلوم الإنسان الحدودي برنامج (RGY 70/2008).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 |
| DNase I | Sigma | D4527-10KU |
| RNase | Sigma | R4642-10MG |
| PEG8000 | Fisher Scientific | BP233-1 |
| SM buffer | Teknova | S0249 |
| NZYM | Teknova | N2062 |
| CsCl | Sigma | C3011-250G |
| Syringe | Becton Dickinson | 309585 |
| Needle | Becton Dickinson | 305176 |
| Dialysis cassette | Thermo Scientific | 66333 |
| Microscope slide | Corning | 2947-75×50 |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 |
| SW40Ti ultra-clear tube | Beckman Coulter | 344060 |
| SW60Ti ultra-clear tube | Beckman Coulter | 344062 |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | 331302 |
| SW60Ti rotor | Beckman Coulter | 335649 |
| Refractometer | Fisher Scientific | 13-947 |
| Epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |
Table 2. Reagents and equipment.
Referenzen
- Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. Switches in bacteriophage lambda development. Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).
- Ptashne, M. . A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).
- Hendrix, R. W. . Lambda II. , (1983).
- Hershey, A. D. . The Bacteriophage lambda. , (1971).
- Zeng, L. Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection. Cell. 141, 682-691 (2010).
- Edgar, R. Bacteriophage infection is targeted to cellular poles. Mol. Microbiol. , (2008).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).
- Fasman, G. D. . Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).
- Kaiser, A. D. On the internal structure of bacteriophage lambda. J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).
- Kobiler, O. Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network. Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).
- Shaner, N. C. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Zeng, L. . Personal communication with M. Feiss. , .
- Schwartz, M. The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity. J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).
