Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Whitney O. Lane; Alexandra E. Jantzen; Tim A. Carlon; Ryan M. Jamiolkowski; Justin E. Grenet; Melissa M. Ley; Justin M. Haseltine; Lauren J. Galinat; Fu-Hsiung Lin; Jason D. Allen; George A. Truskey; Hardean E. Achneck

doi:10.3791/3349

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Biotechnik

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

Published: January 17, 2012

doi:

10.3791/3349

Whitney O. Lane¹, Alexandra E. Jantzen², Tim A. Carlon², Ryan M. Jamiolkowski³, Justin E. Grenet¹, Melissa M. Ley¹, Justin M. Haseltine², Lauren J. Galinat², Fu-Hsiung Lin¹, Jason D. Allen⁴, George A. Truskey², Hardean E. Achneck¹

¹Department of Surgery,Duke University Medical Center, ²Department of Biomedical Engineering,Duke University , ³School of Medicine,University of Pennsylvania , ⁴Department of Medicine, Division of Cardiology,Duke University Medical Center

Summary

Stiamo descrivendo un metodo per soggetto cellule aderenti alle sollecitazioni di taglio a flusso laminare in un circuito sterile flusso continuo. L'adesione delle cellule ', morfologia possono essere studiati attraverso la camera trasparente, campioni ottenuti dal circuito per l'analisi metabolita e le cellule raccolte dopo l'esposizione di taglio per gli esperimenti futuri o della cultura.

Abstract

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere una tecnica per soggetto cellule aderenti alle condizioni di flusso laminare e valutare la loro risposta al taglio fluido ben quantificabili sottolinea ^1.

Il nostro design camera di flusso e flusso del circuito (Fig. 1) contiene una regione trasparente visualizzazione che consente la sperimentazione di adesione cellulare e l'imaging di morfologia cellulare immediatamente prima del flusso (Fig. 11A, B), in vari momenti durante il flusso (Fig. 11C) , e dopo che il flusso (Fig. 11D). Questi esperimenti sono illustrate con cordone ombelicale umano derivati dal sangue le cellule progenitrici endoteliali (EPC) e suina EPC ^2,3.

Questo metodo è applicabile anche ad altri tipi di cellule aderenti, ad esempio, cellule muscolari lisce (SMC) o fibroblasti.

La camera e tutte le parti del circuito sono facilmente sterilizzati in autoclave a vapore. A differenza di altriCamere, ad esempio camere di microfluidica, un gran numero di cellule (> 1 milione a seconda delle dimensioni della cella) può essere recuperato dopo l'esperimento di flusso in condizioni sterili per colture cellulari o di altri esperimenti, come ad esempio l'estrazione del DNA o RNA, o immunoistochimica (Fig. 11E), o microscopia elettronica a scansione ^5. La tensione di taglio può essere regolata variando la portata del perfusato, la viscosità del fluido, o l'altezza e la larghezza del canale. Quest'ultima può ridurre il volume di liquidi o ha bisogno di cellule assicurando nel contempo che unidimensionale del flusso viene mantenuta. Non è necessario misurare l'altezza della camera tra esperimenti, dal momento che l'altezza della camera non dipende l'uso di guarnizioni, che aumenta notevolmente la facilità di esperimenti multipli. Inoltre, il design del circuito consente facilmente la raccolta di campioni perfusato per l'analisi e / o la quantificazione di metaboliti secreti dalle cellule del liquido sotto esposizione shear stress, ad esempio, l'ossido nitrico (fig. 12) ⁶ </sup>.

Protocol

1. Isolamento delle cellule progenitrici endoteliali Prima di qualsiasi raccolta di sangue periferico umano, presentare il vostro protocollo di ricerca al tuo Institutional Review Board (IRB), e dopo la sua approvazione, ottenere dei donatori volontari 'consenso informato (la raccolta del sangue periferico e l'isolamento EPC era stato approvato dalla IRB Duke University e è in piena conformità con i requisiti normativi degli Stati Uniti in materia di protezione dei partecipanti alla ricerca umana). Quando si lavora con derivazione animale EPC, avere il vostro protocollo di ricerca approvato dal Animal Care istituzionale e uso Committee (IACUC). Tutti i nostri esperimenti suina era stato approvato dalla Duke University IACUC e sono state condotte in conformità con i più alti standard di cura umano. Per l'isolamento di cellule progenitrici endoteliali, raccogliere 50 ml di sangue periferico tramite la tecnica salasso standard da un donatore volontario acconsentito in sacchetti di raccolta del sangue riempito con il citrato di anticoagulantefosfato e destrosio e diluire la soluzione 1:1 con soluzione salina tamponata di Hank (senza CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) e lo strato di volumi uguali di HISTOPAQUE per creare livelli ben definiti. Centrifuga (30 min, 740 g, l'impostazione pausa bassa) e raccogliere l'cellule mononucleate (MNC) (buffy coat) layer. Risospendere e lavare multinazionali x 3 con fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS) con 10% siero fetale bovino (FBS) x 10 min, 515 g, prima di placcatura in due da 12 pozzetti in piena mezzo di crescita EPC (MCDB-131 di media con 5 ml di 200 mM di L-glutamina, 10% FBS e EGM-2 SingleQuots) a 37 ° C, 5% di CO 2. Lentamente cambio medio ogni 24 ore per i primi 7 giorni, poi a giorni alterni. Colonie EPC possono essere identificati dopo un tempo medio di 14 giorni in base alla loro morfologia ciottoli. Una volta EPC in ¼ coprire cultura del 12-bene la superficie, espandere le cellule e confermare l'identità EPC con citometria a flusso da test per la presenza di marcatori di superficieCD31 e l'assenza di CD14, CD45 come descritto in precedenza 6. Altri test che possono essere eseguite comprendono morfologia cellulare e di etichettatura con DII-Ac-LDL. Per gli esperimenti descritti nel presente documento, espandere EPC isolato fino a quando sono quasi confluenti in 3 palloni delle cellule T-75 di media cultura in EPC in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2. 2. Sollecitazione di taglio di calcolo Si consiglia di questi calcoli vengono eseguiti prima della fabbricazione della camera e il canale di avere una conoscenza approfondita delle condizioni che possono essere raggiunti. Calcolare la portata del perfusato nel circuito basato sul taglio desiderato sollecitazioni da applicare alle celle secondo l'equazione 1 1, dove Q è la portata desiderata, τ è il bersaglio ssentire lo stress agisce tangenzialmente sulle cellule, w è la larghezza della camera di flusso, h è l'altezza della camera di flusso, e μ è la viscosità del perfusato (media portata). Un valore tipico di viscosità (μ) per il mezzo utilizzato è di 0,9 cP (0,009 g cm -1 s -1). Si noti che la viscosità può anche essere sollevato usando ad elevato peso molecolare destrano, se lo si desidera 7. Un valore tipico di stress obiettivo di taglio (τ) utilizzato è di 15 dyne / cm 2, (tipica sollecitazione di taglio delle arterie) o 100 dyne / cm 2, se sovrafisiologiche sforzo di taglio è voluta. La nostra camera è tipicamente una larghezza (w) di 1,9 cm e altezza (h) nel range di 166-267 micron. 3. Camera di flusso di produzione Tagliare le piastre superiore e inferiore del secolocamera e in lega di alluminio 6061 magazzino rettangolare con dimensione superiore di 7 x 2 "dimensioni e inferiore del 7 x 2 x 0,25" x 0,5. Recess la piastra superiore nella parte centrale a 0,125 "profondo, lasciando 0,950" per fine di 1,375 "di larghezza x 0,3125" serbatoio del liquido profondo. Drill 1 / 16 "di larghezza x 0,625" slot lungo dalla parte inferiore per penetrare al serbatoio sull'afflusso e termina deflusso. Alla fine di ogni piastra superiore, praticare un centrale 10/32 "tracce per pollice (TPI) foro per polipropilene 1 / 8" portagomma per penetrare nel serbatoio del liquido. Al fine di afflusso, creare un plug lato con 10/32 "TPI attraverso il foro per il polipropilene 1 / 8" portagomma. Cono nella parte inferiore dalla parte superiore l'afflusso del fluido alla finestra di visualizzazione in vetro a 0,518 gradi per una adeguata miscelazione di liquido. Tagliare lastra di vetro di una finestra nella piastra inferiore in linea con finestra di visualizzazione superiore. Utilizzando cemento acquario, colla un vetrino nella camera. Lasciare cura per almeno 24 ore.Assicurarsi che la finestra di visualizzazione è incassato in modo che un 75 x 25 x 1 vetrino da microscopio mm vetro siederà a filo nella camera. Creare un incavo per un o-ring di tutto il lato inferiore delle piastre superiore e inferiore in modo che siano distanziate da 0.02 ". Inserire la gomma O-ring. Trapano 10 corrispondenti 8 / 32 "buchi TPI in camere superiore e inferiore per l'utilizzo con 8 / 32" viti a testa piatta. 4. Assemblaggio di flusso circuito Assemblare l'intero circuito primo flusso, quindi procedere con la sua sterilizzazione. Collegare un "segmento di tubo difficile un'estremità del attenuatore delle pulsazioni (via 1 / 8" 36 connessione). All'altra estremità, collegare un 18 "segmento di tubo morbido. Posizionare un 1 / 8 "adattatore maschio luer alla fine dei 18" sezione di tubo morbido, di cui al punto 4.2. Collegare il luer maschio ad un 1 / 8 "adattatore femmina luer. Collegare il luer femmina ad un nuovo 18" tubi nei soft. Praticare tre fori in un bicchiere di vetro tappo 250 ml al fine di adattare tubi. Ionsert da 1,5 "segmento di tubo morbido (come presa d'aria) in una buca e l'estremità libera del tubo hard e soft con gli altri 2 fori nel tappo nella bottiglia di 250 ml in vetro (come riserva) (Fig. 2). Assicurarsi che il tubo dura raggiunge il fondo del serbatoio (come tubi di deflusso dal serbatoio). Sterilizzare le parti sopraindicate in autoclave a vapore a 121 ° C per 60 min. Inoltre autoclave una camera completa di flusso, 3 x 2 "segmenti di tubo morbido, 1 maschio e 1 femmina 1 / 8" adattatore luer, 4 x ½ "e 6 x 5 / 16" 8-32 viti a testa piatta, 1 paio di pinzette , un 75 x 25 x 1 vetrino mm (o altro materiale desiderato della superficie delle cellule), e 2 teli chirurgici. Luogo teli sterili in cappa a flusso laminare. Posizionare il circuito di flusso, camera di flusso, 4 x 4-way rubinetti, 1 x 1-way rubinetto, e tutte le parti sterilizzato dal punto 4,5 su questo campo sterile. Ora usare guanti sterili per collegare due 4-way rubinetti. Tappi posto sulle porte campione aperto. </li> Staccare gli adattatori maschio e femmina luer collegare i due segmenti tubo morbido del circuito di flusso e inserire i rubinetti collegati (Fig. 3). Collegare il tubo morbido inserito nel serbatoio di una siringa da 30 ml e togliere il pistone della siringa. Riempire la bottiglia con 125 ml di EPC media (Fig. 4). Collocare un filtro sterile nella siringa la presa d'aria (Fig. 4). Spostare il circuito di flusso in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2. Bloccare il tubo fisso in testa della pompa rullo indicato per l'uso con questo tipo di tubo (Fig. 5). Assicurarsi che il tubo non si sovrappone con le tracce pompa il rullo di montaggio. Segna il tubo dove esce la testa della pompa su entrambi i lati con un pennarello. Assicurarsi che tutti i rubinetti sono chiusi verso i porti del campione e si aprono lungo il circuito di flusso. Avviare la pompa. Verificare la direzione del flusso. Il perfusato deve muoversi from il serbatoio di vetro attraverso il tubo rigido nel attenuatore delle pulsazioni. 5. EPC fluorescenti etichettatura Mentre il flusso del circuito riscalda a 37 ° C, preparare le cellule per la semina sul vetrino. Si noti che l'etichettatura fluorescente è necessaria se le cellule devono essere visualizzate su materiali opachi, ad esempio, titanio (Ti). Creare un 1 soluzione madre mM di Cell Tracker Orange (CTO) diluendo 50 mcg CTO polvere con 90 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Assicuratevi di proteggere questa miscela da esposizione alla luce (spegnere la luce durante il lavoro sotto cappa a flusso). Creare una soluzione 2 mM di lavoro di CTO diluendo 36 ml di soluzione madre CTO in 18 ml di siero senza MCDB-131 di media. Sciacquare EPC in 3 palloni vicino cellule confluenti T-75 DPBS cultura con 10 ml (senza Ca e Mg). Aggiungere 6 ml di soluzione 2 mM CTO di lavoro ad ogni pallone. Incubare per 15 min a 37 ° C. Risciacquare ogni pallone x 2 con 10 DPBS ml (senza Ca e Mg). <li> Aggiungere 4 ml di tripsina ad ogni pallone. Incubare a 37 ° C per 3 min. Neutralizzare con 8 ml di soluzione di neutralizzazione tripsina. Lavare per centrifugazione x 5 min a 600 g e risospendere in 5 ml di terreno EPC. 6. Semina di cellule di scivolare prima di flusso di assemblaggio camera Una diapositiva fatta di vetro, titanio, o altro materiale può essere utilizzato, e la superficie di scorrimento può essere modificata con polimero spin coating o l'aggiunta di uno strato di metallo. Mettere il vetrino in una sterile rettangolare quattro camere nave coltura cellulare (o tessuto utilizzare fiasco cultura scivolo superficie di polistirolo se si desidera). Contare le celle e semi di 1,5 x 10 6 cellule sul vetrino in 5 ml di EPC medio x 6 ore se uno strato di cellule confluenti è desiderato all'inizio del flusso (Fig. 11A). Al fine di testare la diffusione e l'adesione delle cellule sotto fluido shear stress, permette 3 x 10 6 cellule di aderire solo per 15 minuti prima dell'inizio del flusso (quick-semina) ( <strong> Fig. 11B). 7. Flusso di camera di montaggio Utilizzando guanti sterili, collegare 2 "segmento morbido tubo ad un 1 / 8" adattatore femmina luer. Collegare un altro 2 "segmento morbido tubo ad un 1 / 8" adattatore maschio luer. Collegare il 2 "tubo morbido con adattatore femmina luer alla porta afflusso. Attaccare il 2" tubo morbido con maschio luer alla porta deflusso. Collegare 4-way a due rubinetti di questi adattatori luer. Collegare il restante 2 "pezzo morbido tubo al connettore della porta lato venuta fuori il gorgogliatore e allegare un 1-via rubinetto (Fig. 6). Usando le pinzette sterili, rimuovere la cellula testa di serie diapositiva dal recipiente di coltura cellulare (o se si usa un pallone di diapositive, togliere il pallone sulla slitta) e posizionarlo nella cavità sul fondo piatto della camera di flusso. Assicurarsi che la diapositiva è posta con la cellula-seminato verso l'alto. Pipettare 10 ml di medium caldo EPC sulla diapositiva. Lasciare che il mezzo per coprire la diapositiva e camera di flusso, but non versare il medium nel corso degli O-ring sul fondo piatto. Posizionare la piastra superiore della camera di flusso sulla piastra di fondo, allineando i fori delle viti. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria nella camera durante questa fase, mantenendo le due piastre parallele. Piastre di vite insieme (un automatico a batteria velocità cacciavite questo processo). Rimuovere le bolle d'aria dalla trappola afflusso bolle aprendo il 1-way rubinetto collegato al flusso porta sul lato bolla trappola e lavare delicatamente il tubo di afflusso medio con EPC usando una siringa da 10 ml. Poi chiudere questo rubinetto e tappo (Fig. 7). Ora rimuovere le bolle d'aria dal canale camera aprendo la porta di uscita a 4 vie rubinetto e delicatamente flussaggio EPC attraverso la camera di flusso, sempre usando una siringa da 10 ml. Se bolle di grandi dimensioni rimangono, sollevare l'estremità deflusso della camera ad un angolo di 45 ° (Fig. 8). Cap di tutte le connessioni a 4 vie rubinetto e chiudidi dosso. Spostare la camera di flusso nell'incubatore con il circuito di flusso montato (Fig. 9). Mettere in pausa la pompa del circuito di flusso. Chiudere i rubinetti del flusso circuito nella direzione del flusso per evitare perdite e per mantenere l'interno della camera sterile. Trasporto camera di flusso dalla cappa a flusso al circuito di flusso. Collegare la camera di flusso al circuito di flusso. Aprire i rubinetti in direzione del flusso. Riprendere il flusso della pompa. Assicurarsi che il perfusato scorre nella direzione corretta. Regolare la portata per lo sforzo di taglio desiderato. Durante l'esperimento di flusso, la camera di flusso può essere rimosso dal circuito per l'immagine della luce o cellule tramite microscopia a fluorescenza. Per fare ciò, scollegare la camera di flusso dal circuito di flusso al rubinetto-rubinetto connessioni. Per mantenere la sterilità della camera, chiudere i rubinetti del flusso del circuito e rubinetti camera di flusso nella direzione del flusso e cappuccio tutti i rubinetti prima di rimuovere il circuito di flussodal termostato (Fig. 9). 8. Perfusato raccolta dei campioni Per una facile raccolta di campioni per l'analisi perfusato, (ad esempio la sintesi di ossido nitrico), prima pausa la pompa. Chiudere il rubinetto situato più vicino al attenuatore delle pulsazioni. Togliere il tappo di protezione ed inserire una siringa di piccole dimensioni, ad esempio, siringa da 3 ml, nella porta campione. Mantenere tappo e assicurarsi che non diventerà contaminata mettendolo a testa in giù. Chiudere il rubinetto nella direzione della camera di portata, mantenendo la porta campione e circuito in direzione della attenuatore delle pulsazioni aperto. Disegna quantità desiderata di campione, esempio 150 microlitri, dal circuito. Chiudere il rubinetto verso il porto campione prima di rimuovere la siringa. Conservare il campione perfusato in un flaconcino etichettati e congelare a – 80 ° C (per la determinazione ossido nitrico in un punto secondo momento). Recap della porta campione e assicurarsi che tutti i rubinetti sono aperti prima di iniziare flusso. 9. Rappresentante risultati Utilizzando il nostro metodo rapido di semi, derivati dal sangue umano le cellule progenitrici endoteliali possono essere seminati su vetrini in titanio per 15 minuti e di aderire con fisiologica (arteriosa) forze di taglio di 15 dyne / cm 2. Come mostrato in Figura 10, EPC diffusione sotto l'influsso di flusso da 210 ± 11,4 micron 2, subito dopo la semina, a 657 ± 39,1 micron 2 dopo 3 ore, e fino a 1152 ± 55,3 micron 2 dopo 24 ore di fluido sforzo di taglio di 15 dyne / cm 2 (differenza tra i due gruppi è statisticamente significativa con p <0,0001, 1-way ANOVA). Parallelamente all'aumento della superficie delle cellule, che possono essere esposte attraverso la camera trasparente con microscopio a luce o fluorescenti, la rotondità calcolata secondo l'equazione 2 6 / Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/> è diminuito da 878 x 10 -3 ± 5.9 x 10 -3, subito dopo la semina, a 671 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 dopo 3 ore, e di 526 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 dopo 48 ore della stessa esposizione sforzo di taglio fluido (differenza tra i gruppi è di nuovo statisticamente significativa con p <0,0001, 1-way ANOVA). Figura 11D dimostra che EPC allineare e orientare nella direzione del flusso dopo 48 ore di liquido sforzo di taglio a 15 dyne / cm 2 rispetto al loro orientamento casuale, dopo un periodo di semina statico di 6 ore, mostrata in Figura 11A. Il nostro metodo permette anche di ottenere campioni del perfusato a tempi predeterminati per l'/ o l'analisi e la quantificazione dei metaboliti delle cellule secreto. Come un esempio rappresentativo che raffigurano la produzionezione di nitriti (NO 2 -) durante un esperimento di flusso 48 ore con EPC suina in Figura 12. Abbiamo misurato direttamente il prodotto primario dell'ossidazione di ossido nitrico (NO) come marker surrogato di NO nei campioni raccolti medio dal circuito del flusso nei punti di tempi diversi da 12,0 nmol a 6 ore, 13.1 nmol a 12 ore, 16.3 nmol a 24 ore, e il 24,6 nmol dopo 48 ore per 1 x 10 6 celle a 15 dyne / cm 2 6. Figura 1. Schematica che mostra una panoramica del circuito di assemblaggio di flusso e flusso di esperimento. (A) circuito di assemblaggio di portata senza la camera di flusso. Vi sono incluse nel serbatoio, attenuatore di pulsazioni, tubi rigidi, tubo morbido, 4-way rubinetti e collegato adattatori luer, così come il filtro dell'aria. (B) Collegamento della camera di flusso attraverso il segmento di tubo rigido alla testa della pompa di flusso. (C) In serimento della CBE testa di serie scivolare la piastra inferiore della camera di flusso (D). Completa il montaggio del circuito flusso con la camera di flusso. Figura 2. Circuito flusso Completamente assemblato per la sterilizzazione. Figura 3. Circuito flusso assemblato dopo la sterilizzazione con rubinetti incluso. Figura 4. Riempire il serbatoio di vetro con 125 ml di terreno EPC. Figura 5. Flusso circuito bloccato nella testa della pompa flusso prima dell'inserimento del flusso da camera. jpg "/> Figura 6. Top Assieme piastra da camera. Figura 7. Flushing il gorgogliatore di medio EPC per rimuovere le bolle afflusso dal lato della camera. Figura 8. Flushing la camera di medio EPC per rimuovere le bolle dalla diapositiva e lato uscita della camera. Figura 9. Completamente assemblato circuito di flusso con camera di flusso inserito nel corso di un esperimento di portata. Figura 10. Zona EPC (in micron 2) aumenta nel corso del tempo l'esperimento di flusso. files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/> Figura 11. (A) immagine al microscopio di Luce HUCB EPC seminate su un vetrino fibronectina vetro rivestito x 6 ore prima di scorrere a 100 ingrandimenti. (B) HUCB EPC etichettati con CTO e rapido seminate su un vetrino Ti x 15 minuti prima di fluire, visualizzata con la microscopia a fluorescenza a 100 ingrandimenti. (C) La stessa diapositiva Ti con EPC HUCB come sotto (B), dopo 3 ore di flusso a 100 dyne / cm 2 e ripreso attraverso la camera trasparente a 100 ingrandimenti. Notare l'orientamento diffusione di cellule, ma comunque casuale dopo 3 ore di flusso. (D) La stessa diapositiva Ti, ora dopo 48 ore di esposizione del flusso a 100 ingrandimenti. EPC sono etichettati con CTO e nuclei delle cellule sono colorate con Hoechst colorante (blu) dopo che il flusso. Si noti l'allineamento delle cellule nella direzione del flusso. (E) EPC suina per il confronto su Ti dopo 48 ore di flusso e 15 dyne / cm <sup> 2 di esposizione sforzo di taglio. I bordi delle celle sono state colorate con anticorpi anti-macchia PECAM (verde) e nuclei con Sytox Acid Orange nucleici macchia. Si noti l'allineamento delle celle nella direzione del flusso. Grafico figura 12. Illustra la produzione di NO di EPC suina nelle 48 ore di flusso. Un prodotto di ossidazione primario di NO, nitriti (NO 2 -), è stata misurata come un marker surrogato di NO da campioni di media raccolti in diversi momenti durante il flusso. Figura 13. La camera di flusso è realizzato in lega di alluminio 6061 magazzino rettangolare, con la sezione superiore (A) è 0,5 "x 2" x 7 "e la sezione inferiore (B) 0,25" x 2 "x 7" in dimensione. Il piano èpiallate sul lato inferiore della O-ring superficie di contatto a 0,45 "al fine di assicurare la planarità per la sigillatura. La parte superiore è incassato nella sua parte centrale a 0,125", che lascia 0.95 "al fine di una 0,3125" x 1,375 "serbatoio del liquido. Il serbatoio parte superiore è filettato 3/8-24 TPI e 0,25 "in profondità per ricevere le spine filettate in acciaio inox. Slot di misura 1 / 16 "x 0,625" sono stati lavorati nella parte inferiore che penetrano al serbatoio. La spina lato afflusso ha un 10/32 "foro passante per un polipropilene 1 / 8" portagomma da collegare al rubinetto. Ogni unità ha un fine in posizione centrale filettato 10/32 TPI da 0,25 "per una porzione profonda polipropilene 1 / 8" portagomma alla fine 0,45 "x 2". Le estremità utilizzare un 0,07 "buco dal fondo di fili di penetrare attraverso il serbatoio. La parte inferiore della parte superiore ha una superficie conica 0,6875" di larghezza, 0,518 gradi dal centro di uno slot LH per una distanza di 1,460 ". Questo cono fonde ad una zona pianeggiante 0,6875 "x larga 0,0118" in profondità e 0,590 "dalla fine del vetros (o altra superficie, far scorrere in titanio per esempio) recesso. L'appartamento deve essere a filo con il vetro (o altra superficie, far scorrere in titanio ad esempio) una volta che la diapositiva è installato. Il cono e piatto sono lucidati. La superficie del vetrino è 0,0118 "incassato dalla superficie inferiore. La 0,0118" nicchia continua a slot serbatoio sul lato destro. Un O-ring è incassato interamente intorno slot e far scorrere lasciando 0.020 "della superficie originale tra l'O-ring groove e diapositive. La parte superiore e le unità inferiori sono forati per una decina di buche. La parte superiore ha fori passanti per 8 / 32 TPI svasata piana viti a testa. La sezione inferiore ha fori posti corrispondenza dei fori in alto e sono filettati 8 / 32 TPI. L'unità di fondo ha un chiaro scorrono a filo vetro incasso finestra con la sua superficie si trova sopra il vetrino superficie cellulare (o scivolare in titanio). L'unità ha un O-ring scanalatura che comprende slot nell'unità superiore con larghezza di lasciare 0.04 "della superficie originaria tra il vetrino inferiore e quello interno O-ring scanalatura. L'O-rings sono silicone rosso AS568A, Dash Numero 044 per la sezione superiore e 046 per la sezione in basso.

Discussion

Il nostro circuito di flusso e camera di flusso permettono di soggetto cellule aderenti, EPC per esempio, alle sollecitazioni di taglio fluido definito. Dal momento che la parte superiore della camera e in basso sono trasparenti, l'adesione cellulare e la morfologia possono essere valutati sia in tempo reale, attraverso la camera stessa, o dopo un esperimento di flusso e lo smontaggio della camera di flusso. A quel punto, le cellule possono essere raccolte in condizioni sterili e sia ri-placcato, o utilizzati per raccogliere il loro DNA o RNA, ecc, per ulteriori analisi.

Per ottenere flusso laminare, il design della camera deve essere tale che diverse condizioni siano soddisfatte.

In primo luogo, il flusso deve essere laminare, che può essere verificata calcolando il numero di Reynolds (Re), che è il rapporto di forze inerziali a forze viscose. (Se le forze viscose predominano, Re è piccolo e il flusso è laminare o 'completamente sviluppato' – di solito per Re <2300.Se le forze inerziali predominano, il flusso diventa sempre più casuale fino a quando non è turbolento, come nel caso di Re> 4000.) Possiamo calcolare Re secondo l'equazione 3 ^8,

Dove ρ è la densità del fluido, Q è la portata, μ è la viscosità, w e h sono la larghezza e l'altezza della camera, rispettivamente, e D _h è il diametro idraulico, definito secondo l'equazione 4 ^8,

Il numero di Reynolds delle nostre camere flusso tre, con altezze che vanno dal 166-267 micron, range 13,9-34,6 ai tassi di flusso calculated per ottenere un sforzo di taglio di 15 dyne / cm ^2. A portate calcolate per un sforzo di taglio di 100 dyne / cm ^2, il numero di Reynolds delle camere variava dal 90,4-234. Tutti questi numeri di Reynolds sono molto inferiori a 2300 e soddisfare il criterio di flusso laminare.

In secondo luogo, per il campo di velocità e di sforzo di taglio deve essere indipendente dalla distanza lungo il canale di flusso (cioè completamente sviluppate), la distanza dalla presa di scorrere fluido deve essere più lungo rispetto alla lunghezza d'ingresso, _e L. Questo può essere soddisfatta calcolando la lunghezza d'ingresso, secondo l'equazione 5 ^9.

Per i valori di cui sopra, la lunghezza d'ingresso varia 0,01-0,25 cm.

In terzo luogo, al fine di assicurare che la velocità e lo stress di taglio in direzione laterale non varianosignificativamente dal valore di unidimensionale del flusso del canale (Ph Δ / 2L), il rapporto h / w deve essere molto minore di 1. Per il carico medio di taglio a parete sotto bidimensionale condizioni di flusso per il 95% della sollecitazione di taglio muro con una dimensione di flusso, h / w deve essere uguale a 0,10, e per lo sforzo di taglio muro sotto bidimensionale condizioni di flusso da 97,5% dello sforzo di taglio muro con una dimensione di flusso, h / w deve essere uguale a 0,05. Con le dimensioni della nostra camera di flusso progettato 1,7 centimetri in larghezza e 166-267 micron di altezza, questi criteri sono soddisfatti.

La pressione varia solo nella direzione del flusso se non ci sono gradienti di pressione laterale all'ingresso. Questo può essere valutato utilizzando coloranti o particelle nel percorso del flusso. Inoltre, per esperimenti di flusso costante, un attenuatore delle pulsazioni è inserita nel circuito del flusso. L'attenuatore delle pulsazioni tira fuori la maggior parte della pulsatility causato dalla pompa rullo nel circuito, e ci permette di approssimare l'ipotesi di flusso costante. Da notare che il attenuatore delle pulsazioni utilizzati devono essere compatibili con la pompa e il tubo utilizzato nel circuito, in modo che possa effettivamente eliminare pulsazioni nel flusso di output per le frequenze specifiche della pompa rullo. Nella nostra dimostrazione L / S Masterflex ammortizzatore di pulsazioni raggiunge flusso laminare quando utilizzato sulla linea di scarico con qualsiasi M / L pompa serie Masterflex (0-600 RPM) e I / P 26 tubi. Per un flusso pulsatile, una pompa programmabile può essere utilizzato per generare forme d'onda diverse.

Per un flusso pulsatile, una pompa programmabile può essere utilizzato per generare forme d'onda diverse.

Inoltre, il circuito è progettato in modo tale che i campioni di perfusato possono facilmente essere raccolti in tempi diversi senza rischio di contaminazione delle cellule o media portata. Nel nostro esempio, la concentrazione di NO ₂ – è stata misurata mediante chemiluminescenza conuno Ionics / Sievers Analizzatore di ossido di azoto (NOA 280, Strumenti Sievers, Boulder, CO), come descritto in precedenza ^10. Il riducente utilizzato per l'analisi è stata nitrito di ioduro di potassio in acido acetico (14,5 M di acido acetico e 0,05 M KI), che ha il potenziale di riduzione di convertire nitrito di NO, ma non è sufficiente a ridurre eventuali ossidi di azoto superiore come il nitrato ed è quindi relativamente specifici per nitriti. Il nitrito importo totale prodotta è stato calcolato come il prodotto della concentrazione prodotta e il volume totale del circuito durante la regolazione del volume perso, mentre il prelievo di campioni ^6.

I seguenti passaggi sono fondamentali per la riuscita di esperimenti di flusso:

È auspicabile per evitare la formazione di bolle durante il flusso di set-up, dal momento che le bolle hanno il potenziale per strappare le cellule dalla loro superficie. Questo può essere evitato facendo attenzione a quando si posiziona la parte superiore della camera di flusso sulla parte inferiore, che è megliocompiuta tenendo entrambe parallele l'una all'altra e abbassando la parte superiore sul fondo in un unico movimento senza modifiche. In tal modo, piccole bolle d'aria che possono essere presenti e / o galleggiante nel canale di flusso, sarà deviato nelle trappole bolla alle due estremità del contenitore in alluminio.
E 'importante assicurarsi che il tubo deflusso nel bacino raggiunge fino al fondo del serbatoio è. In caso contrario, l'aria può essere risucchiato nel tubo che porta dal serbatoio alla camera se il livello scende leggermente al di sotto perfusato fine tubo.
Il ricercatore deve avere familiarità con la direzione del flusso della pompa in modo che la pompa non accidentalmente correre nella direzione opposta con l'inizio del flusso, il che si tradurrebbe in aria risucchiata nel circuito e da camera.
Per evitare la formazione di schiuma (a causa di proteine denaturate contenute nel siero), si consiglia di abbassare il tubo che porta dalla camera al serbatoio a circa un centimetro al di sopra del perfusate livello all'interno del serbatoio. Tuttavia, mantenendolo al di sopra del livello medio di flusso consente di verificare il flusso nel serbatoio durante l'esperimento.
Al momento di collegare le parti della camera insieme, è importante afferrare saldamente la custodia con una mano durante l'utilizzo del cacciavite elettrico con l'altra mano. Si noti che il movimento del cacciavite elettrico si tradurranno in una coppia che ha il potenziale di 'scagliare la camera intorno' una volta che la vite è serrata.
Per evitare la formazione di onde di pressione nel circuito e il sollevamento delle cellule i loro superficie, in modo che tutti i rubinetti sono aperti prima di iniziare il flusso.
Soprattutto per gli studi di flusso a più lungo termine (> 48 ore) si consiglia di utilizzare il tubo più duro e più resistente di essere inserito nella testa della pompa per evitare rottura dei tubi.
E 'possibile che i tubi' migra 'all'interno della testa della pompa a causa di denti pompa mal regolata testa. Pertanto si consiglia attenzione a come la vascaING è fissato nella testa della pompa e la marcatura ogni estremità del tubo con un pennarello in modo tale che si può facilmente notare se il tubo è 'tirato in' o staccato durante l'esperimento.
Sempre verificare attentamente ogni singolo connettore del circuito e da camera prima di iniziare la perfusione al fine di evitare perdite di perfusato durante un esperimento a causa di un collegamento difettoso. Ciò è particolarmente importante per i connettori di afflusso e deflusso di smorzatori di impulsi!
Ricordatevi di limitare l'esposizione alla luce se si utilizzano etichette fluorescenti.

Una limitazione possibile della nostra camera di flusso è che l'altezza è fissata per l'altezza del canale lavorati in alluminio. Tuttavia, questo ha il vantaggio di non dover verificare e regolare l'altezza del canale prima di ogni esperimento e semplifica quindi i calcoli sforzo di taglio, semplicemente regolando la portata della pompa al valore desiderato. A seconda degli obiettivi della ricerca, può essere auspicabileaumentare la tensione di taglio senza aumentare la velocità della pompa. In questo caso si consiglia di aumentare la viscosità del perfusato è, ad esempio l'aggiunta di destrano al medium ^11.

Una possibile limitazione del circuito flusso è il grande volume di mezzo utilizzato, che può essere problematico quando si tenta di quantificare le concentrazioni molto piccole di metaboliti cellulari. Anche se non qui, è possibile ridurre considerevolmente il livello del circuito utilizzando un serbatoio più piccolo e attenuatore delle pulsazioni e diminuire lunghezza del tubo e il diametro.

Inoltre, ci sono parecchi altri sistemi disponibili in commercio che possono essere utilizzati per applicare liquidi shear stress alle cellule in coltura. Microfluidica sistemi basati, ad esempio il sistema BioFlux da flussione, consentono analisi simultanea di cellule in diversi canali di flusso microfluidica caricato con soluzione in pozzetti in qualità di ingresso e di uscita serbatoi per questi canali ^12,13,14. Tuttavia, queste e altre microsistemi fluidici non sono compatibili con vetrini da microscopio standard e non consentono il recupero di un numero sufficientemente ampio di celle per ulteriori esperimenti, come la RT-PCR o Western Blot. Inoltre, sono meno user-friendly, un costo minimo di $ 40.000 e possono raggiungere un totale di più di 100.000 dollari, a seconda del materiale accessorio.

Due sistemi macrofluidic disponibili dall'Aeroporto Internazionale di Flexcell Corporation, lo Streamer Flexcell ei sistemi FlexFlow, sono stati utilizzati con successo per studiare le cellule endoteliali ^15,16,17, cellule umane anello ¹⁸ e ¹⁹ fibroblasti in condizioni di flusso del fluido. Un terzo sistema, disponibile attraverso GlycoTech, è stato utilizzato per studiare l'adesione delle cellule tumorali ²⁰ e l'adesione dei leucociti da ²¹ a monostrati endoteliale.

Il sistema Streamer consente diverse diapositive per essere eseguito nelle stesse condizioni di stress di taglio in una sola volta, ma manca di un valore e – a differenza dei nostridesign – non consente visualizzazione in tempo reale delle cellule in condizioni di flusso.

Il sistema FlexFlow ha una finestra di visualizzazione, ma richiede un microscopio verticale, che potrebbe non essere il microscopio standard utilizzato nella maggior parte dei laboratori. Inoltre, il sistema FlexFlow richiede una cella rivestita vetrino per essere invertita, quando sono immessi nella camera di flusso. Questo impedisce la visualizzazione di cellule fluorescenti su una superficie opaca, come il titanio rivestita di vetro, che dimostriamo nel nostro studio. Infine, il copri-specialistici devono essere acquistati appositamente per il sistema FlexFlow, che si trova nella multi-mille dollari fascia di prezzo, simile al sistema Streamer Flexcell.

GlycoTech offre circolari e rettangolari a piatti paralleli camere di flusso, che sono significativamente meno costoso, ma realizzati in acrilico, colato, che non possono essere comodamente staminali in autoclave come la nostra camera. Da segnalare, camere flusso altre che sono state descritte da autoclavabiliapparire impraticabile perché richiedono particolari lenti microscopiche ^22,23. Il sistema utilizza GlycoTech guarnizioni in gomma di silicone interposto tra le piastre superiore e inferiore, che cambierà di spessore con l'uso ripetuto e quindi modificare l'altezza della camera nel corso del tempo (il produttore consiglia l'acquisto di nuovi dopo ogni dieci usa). La nostra camera di alluminio con built-in o-ring permette di opposizione completa di piastre superiore e inferiore e garantisce un'altezza costante camera tra esperimenti. Infine, pompe a vuoto sono necessari per ottenere una tenuta guarnizione in molti disegni camera di flusso, tra cui le camere GlycoTech, che non sono necessarie nel nostro design.

Considerando che non qui, la camera di flusso può essere tenuta sotto un microscopio durante l'esperimento intero flusso di imaging in tempo reale di adesione cellulare e / o comportamenti. Se questo è desiderato, si consiglia di utilizzare lampade a calore o un tappetino riscaldato sotto la camera per mantenere la temperatura perfusato a 37 ° C. Pelliccialì, la pompa rullo può essere sostituita con una pompa a siringa, se no 'riciclo' di due cellule o metaboliti o farmaci sperimentali o agenti si desidera ^24.

E 'anche possibile flusso di cellule diversamente etichettato più di cellule aderenti, ad esempio le piastrine fluorescenti su uno strato di EPC confluenti (usando il test delle piastrine descritto da Achneck et al. ^6,25) per valutare cellula-cellula interazione in condizioni di stress di taglio fluido. La nostra camera di flusso combina caratteristiche di valore delle altre camere di flusso disponibili, ad esempio una porta di campionamento perfusato e una finestra di visualizzazione e ha l'importante vantaggio di compatibilità sia con un microscopio invertito o verticale. E 'completamente autoclavabile e permette di esperimenti ripetuti in altezza della camera costante e senza la necessità di pompe per vuoto ad ottenere una tenuta stagna.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Joe Owen nello strumento Biomediche e Centro di lavorazione per il suo instancabile impegno nella lavorazione e l'assemblaggio delle parti flusso da camera e Matt Maudsley da Leica Microsystems per aiutare nelle tecniche di celle di immagine attraverso camere di flusso. Siamo in debito con Kevin Collins da Servizi perfusione Duke e il dottor Steve Wallace presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica per i suggerimenti utili su progettazione del flusso di circuito. Vorremmo anche ringraziare la National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program per il supporto Alexandra Jantzen e il NIH per il loro sostegno attraverso Grant "rivestimento EPC autologhe per migliorare la biocompatibilità dei dispositivi di assistenza circolatoria" RC1HL099863-01.

Materials

Products / Reagents	Company	Product #
10 ml Syringe	Cole Parmer Instrument Co.	07940-12
1-Way Stopcoks	Cole Parmer Instrument Co.	30600-00
30 ml Syringe	BD Medical	309650
4 -Way Stopcocks	Cole Parmer Instrument Co.	30600-04
Aluminum Alloy	N/A	6061
Cell-Culture Dishes (4-well, rectangular)	Thermo Scientific; Nunc	267061
Cell Tracker Orange	Invitrogen	C34551
DMSO	Research Organics	2162D
DPBS (-/-)	Invitrogen	14190-144
EGM-2 Singlequots	Lonza	CC-4176
Female Luer Adaptor	Cole Parmer Instrument Co.	SI-45500-04
Fibronectin	Sigma	F0895-2MG
Glass Bottle (250ml) with Cap	Cole Parmer Instrument Co.	34594-24
Hard Tubing	Cole Parmer Instrument Co.	06508-16
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Histopaque	Sigma	H8889-500ML
Hoechst Stain Solution	Sigma	H6024
Hyclone FBS	Thermo Scientific	SH30071.01
L-glutamine	Lonza	17-605E
Male Luer Adaptor	Cole Parmer Instrument Co.	EW-45505-04
MCDB-131, 1X Medium	Cellgro	15-100-CV
Barbed Polypropylene Fittings	Cole Parmer Instrument Co.	06365-90
O-Rings	N/A	AS568A
Pulse-Dampener	Cole Parmer Instrument Co.	07596-20
Pump-Drive (Masterflex L/S variable-speed economy drive)	Cole Parmer Instrument Co.	7524-40
Pump-Head (Masterflex Easy Load Pump Head)	Cole Parmer Instrument Co.	07518-60
Slide	Cole Parmer Instrument Co.	48500-00
Soft Tubing	Cole Parmer Instrument Co.	96400-16
Syringe filter	Cole Parmer Instrument Co.	02915-12
Sytox Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S-11368
Trypsin EDTA	Lonza	CC-5012
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002

Referenzen

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Lane, W. O., Jantzen, A. E., Carlon, T. A., Jamiolkowski, R. M., Grenet, J. E., Ley, M. M., Haseltine, J. M., Galinat, L. J., Lin, F., Allen, J. D., Truskey, G. A., Achneck, H. E. Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress. J. Vis. Exp. (59), e3349, doi:10.3791/3349 (2012).