Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

Ver Figura 1 para un ejemplo que resume el siguiente protocolo. Nota de seguridad: Todo el material que ha estado en contacto con el ensamblado de partículas virales se debe desinfectar con una solución de Virkon o desinfectante adecuado. 1. Preparación de las poblaciones de ADN plásmido (~ 2 días) Los plásmidos son necesarios los siguientes 1: pRV1 – Con un contenido de la Rep AAV2 y secuencias de Cap pH21 – Con un contenido de la Rep AAV1 y secuencias de Cap pFdelta6 – Adenovirus-helper plásmido AAV plásmido que contiene el cassette de expresión recombinante flanqueado por AAV2 señales de empaquetamiento (repeticiones terminales invertidas, RTI) Mientras pFdelta6 deben cultivarse en Stbl2 células competentes para evitar la eliminación parcial, pRV1 y pH21 se pueden cultivar en las células DH5alpha competente. AAV plásmidos pueden ser cultivadas en células Stbl2 si deleciones parciales ocurren en las células DH5alpha. Plásmido de ADN debe ser de alta calidad y libre de contaminantes ARN. Los plásmidos pueden ser examinados para la integridad utilizando los siguientes compendios: pRV1 – digestión con XbaI para dar a las bandas de 7,5 kb y 3,8 kb pH21 – digestión con EcoRI para dar a las bandas de 4,5 kb, 2,8 kb y 0,2 kb pFdelta6 – digestión con HindIII para dar a las bandas de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, kb y 2,3 kb 1.5 2. Preparación de las células embrionarias humanas de riñón 293 (HEK293) para la transfección (2 – 3 días) Placa de dos 80% confluente de 150 cm 2 frascos de células HEK293 en cinco de 15 cm de diámetro placas de cultivo de tejidos Nunc. Las células deben ser de 70 – 80% confluentes antes de la transfección (aproximadamente 48 horas después de la siembra). Las células de cultivo en medio estándar Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) con bajos niveles de glucosa que contiene 10% de suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina 100 mg / ml. 3 horas antes de la transfección DMEM eliminar y sustituir por Iscove'S medio modificado de Dulbecco (IMDM) que contiene 5% de suero fetal bovino. 3. Transfección de plásmidos virales (aproximadamente 1 hora para la transfección, 3 días de incubación) Prepare las siguientes personas por un solo lote (5 x 15 cm placas de cultivo de tejidos) de virus: 62,5 g del plásmido AAV 125 mg pFdelta6 31,25 mg pRV1 31,25 mg pH21 1650 l 2,5 M CaCl 2 12 ml dH 2 O En una clase de dos filtros de tejido cubierta de cultivo estéril la mezcla de transfección en un tubo de 50 ml. Mientras agitación de la solución, añadir rápidamente 13 ml de HEPES 2 x solución salina tamponada (pH 7,05). Vuelva a colocar la tapa del tubo de 50 ml y continuar vórtice durante 15 segundos. Dejar reposar durante 1 minuto y 45 segundos, un precipitado blanco fino debe formar. Suavemente añadir 5 ml de la solución de transfección a cada placa de cultivo de 15 cm de tejido. Placas de remolino para mezclar y retorno a la incubadora. 16 horas después de la transfección medio IMDM eliminar y reemplazar con DMEM. 4. Lisis de las células y la cosecha de rAAVs (2 horas) 72 horas después de la transfección, retire el material de las placas de cultivo celular y descarte. Todos los residuos deben ser tratados con una solución de Virkon o desinfectante adecuado. Lave suavemente las células de fosfato 1x caliente (PBS, pH 7,4). Añadir 25 ml de PBS caliente a cada plato y retire suavemente las células con un rascador de células. Recoger la suspensión en tubos de 50 ml. Pellet células a 800 g durante 10 minutos. Desechar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, el uso de 10 ml por placa de cultivo de tejidos. Dividido en dos tubos de 50 ml. Prepare una solución fresca de desoxicolato de sodio al 10% en dH 2 O. Añadir 1,25 ml de este a cada tubo, para una concentración final de 0,5%. Añadir benzonasa nucleasa a una concentración final de 50 unidades por ml. Mezclar el tubo completamente. <li> Se incuba a 37 ° C durante 1 hora. Eliminar los restos celulares por centrifugación a 3000 xg durante 15 minutos. Traslado al nuevo tubo de 50 ml, asegurar que todos los restos celulares se ha eliminado para evitar el bloqueo de las columnas de la heparina (ver paso 5). En esta etapa, las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C antes de continuar. Hemos almacenado las muestras durante varias semanas a -20 ° C sin reducción de la infectividad. 5. Purificación de columna de heparina de rAAVs (2 – 3 horas) Configuración de columnas HiTrap heparina usando una bomba peristáltica para que las soluciones de flujo a través de la columna a 1 ml por minuto para los pasos 5.2 a 5.4. Es importante asegurarse de que no queden burbujas de aire introducido en la columna de heparina. Equilibrar la columna con 10 ml de NaCl 150 mM, 20 mM Tris, pH 8,0. Aplicar 50 ml de solución de virus de la columna y permitir que fluya a través. Lavar la columna con 20 ml de NaCl 100 mM, 20 mM Tris, pH 8,0. Con una jeringa de 5 ml seguir lavando la columna wITH 1 ml de 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, seguido de 1 ml de NaCl 300 mM, 20 mM Tris, pH 8,0. Deseche el flujo continuo. Utilizando jeringas de 5 ml y eluir una presión suave que el virus de la columna mediante la aplicación de: 1,5 ml de 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 3,0 ml de 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 1,5 ml de 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 Recoger estas en un tubo de centrífuga de 15 ml. 6. La concentración y la filtración estéril de rAAVs (1 hora) Concentrado de vectores usando Amicon Ultra-4 unidades de filtro centrífugo con un límite de peso molecular 100.000. Carga de 4 ml de eluido de la columna en la planta concentradora y se centrifuga a 2000 xg durante 2 minutos (a temperatura ambiente). Deseche caudal contínuo y el concentrador vuelva a cargar con la solución de virus restantes y repita la centrifugación. El volumen de concentrado debe ser de aproximadamente 250 l. Si el volumen de concentrados es mucho más que eso, deseche el flujo tediante y seguir los pasos de centrifugación en un minuto hasta que el volumen es de aproximadamente 250 l. Añadir 250 l de PBS al virus por un volumen final de 500 l y retirar del concentrador. Vector a través de un filtro de 13 mm de diámetro 0,2 micras filtro de jeringa. Vector debe ser en alícuotas y se almacenó a -80 ° C hasta su utilización. 7. Titulación de los stocks de virus (3 días) Esto requiere de un promotor que es activo en células HEK293 la conducción de un gen reportero o un producto del gen immunocytochemically detectable. Cuando se produce un vector que no es compatible con las células HEK293 otras líneas celulares o cultivos primarios de células se pueden utilizar. Prepare 18 poli-L-lisina cubreobjetos de vidrio recubiertos o 18 pozos de la cámara de diapositivas Nunc sembrando células HEK293 para que sean 40 – 50% confluente. Para la titulación de Cre-dependiente rAAVs uso HEK293 células que expresan establemente la recombinasa Cre 2. Infectar bien con serie dilutions del vector AAV (Fig. 2A). Utilice 3 pocillos por cada dilución. Nosotros habitualmente añaden el virus directamente a cada pocillo. Después de 72 horas fijar HEK293 células mediante la adición de un volumen igual de paraformaldehído al 4% (PFA) a medio (dando una concentración final de 2% PFA) durante diez minutos a temperatura ambiente. Lávese las células tres veces en PBS, enjuague en dH 2 O y cubreobjetos. Cuente el número de células transducidas de los tres pozos que tienen el mayor factor de dilución, pero aún contienen células infectadas, encontrar el promedio de estos y se multiplica por el factor de dilución para obtener el número de unidades infecciosas por microlitro (Fig. 2B). 8. Los resultados previstos HEK293 células transducidas con una codificación de virus se muestran aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) en la Figura 2B. Por lo general, lograr títulos constante de alrededor de 6 x 10 6 partículas infecciosas por microlitro. Nosotros usamos estos vectores para estereotáxica de colcción en el cerebro de roedores adultos. Esto proporciona una poderosa técnica para la región de la expresión génica específica 2. Para combinar esta especificidad región con la expresión de genes de células de tipo selectivo que se inyectan la recombinasa Cre-dependiente rAAVs en las regiones objetivo de Cre-ratones transgénicos 2. Figura 2C-E se muestran ejemplos de las inyecciones estereotáxica de Cre-dependiente rAAVs codificación eGFP en diferentes regiones del cerebro de ratones adultos parvalbúmina-Cre transgénicos 3. Figura 1. Esquema del protocolo para la producción de rAAV. 1.) HEK293 células se colocan y crecido a 70 a 80% de confluencia. 2.) Plásmidos AAV y el ayudante se preparan y se transfectaron en células HEK293. 3.) Media pasa a ser DMEM 16 horas después de la transfección y HEK293 células se cultivan durante otras 56 horas. 4.) HEK293 células se cosechan y se lisan. rAAV vectores están separados de los restos celulares por centrifugation. 5.) Las partículas virales se purifican a través de columnas de heparina antes de la concentración y la esterilización. 6.) HEK293 células se cultivan en placas de 24 pocillos e infectar con diluciones seriadas de los vectores AAV para determinar el número de unidades infecciosas. Figura 2. Titulación y aplicación in vivo de rAAV1 / 2. (A) la instalación de células HEK293 para medir el título viral. HEK293 células se transducen con diluciones seriadas de rAAVs. C, el control no infectados, N, 1 l de stock viral sin diluir. (B) HEK293 células infectadas con rAAVs expresan EGFP. (CE) eGFP expresión viral se limita a Cre-neuronas que expresan en las diferentes zonas piloto de parvalbúmina-Cre ratones transgénicos después de la inyección estereotáxica de Cre-activa rAAVs. Las imágenes muestran ejemplos inmunorreactividad en las buenas prácticas agrarias (C) el pálido reticular del tálamo y el globo, (D) y el giro dentado (E) de la región CA1 del hipocampo. DG, dentate giro, RT, núcleo reticular talámico, GP, globo pálido. Las barras de escala: B, 500 m; C, 100 m; D, 100 m; E, a 500 micras.