Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

Zie figuur 1 voor een illustratie waarin de volgende protocol. Veiligheid Opmerking: Alle materiaal dat in contact is geweest met de gemonteerde virale deeltjes moet worden gedesinfecteerd met Virkon oplossing of een ander geschikt desinfectans. 1. De voorbereiding van plasmide DNA voorraden (~ 2 dagen) De volgende plasmiden zijn vereist een: pRV1 – bevattende de AAV2 Rep en Cap sequenties pH21 – bevattende de AAV1 Rep en Cap sequenties pFdelta6 – Adenovirus-helper plasmide AAV plasmide dat het recombinante expressiecassette geflankeerd door AAV2 verpakking signalen (inverted terminal repeats, ITRs) Terwijl pFdelta6 moeten worden gekweekt in Stbl2 competente cellen op gedeeltelijke verwijdering te voorkomen, kan pRV1 en pH21 worden gekweekt in DH5alpha competente cellen. AAV plasmiden kunnen worden geteeld in Stbl2 cellen als partiële deleties optreden in DH5alpha cellen. Plasmide DNA moet van hoge kwaliteit en vrij van verontreinigingen RNA. Plasmiden kunnen worden gescreend op integriteit met de volgende verteert: pRV1 – verteren met Xbal aan banden van 7,5 kb en 3,8 kb te geven pH21 – verteren met EcoRI om banden van 4,5 kb, 2,8 kb en 0,2 kb te geven pFdelta6 – verteren met HindIII om banden van 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb en 1,5 kb te geven 2. Voorbereiding van de Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) cellen voor transfectie (2 – 3 dagen) Plaat twee 80% confluent 150 cm 2 flessen van HEK293 cellen in vijf 15 cm diameter Nunc weefselkweek gerechten. De cellen moeten worden 70 – 80% samenvloeiende voor transfectie (ongeveer 48 uur na plating). Cultuur cellen in standaard Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met een lage glucose met 10% foetaal kalf serum en 100 U / ml penicilline / 100 ug / ml streptomycine. 3 uur voor transfectie te verwijderen DMEM en te vervangen door Iscove'S gewijzigde Dulbecco's medium (IMDM) met 5% foetaal kalf serum. 3. Transfectie van virale plasmiden (~ 1 uur voor transfectie, drie dagen voor de incubatie) Bereid het volgende voor een enkele partij (5 x 15 cm weefselkweek platen) van het virus: 62,5 microgram AAV plasmide 125 ug pFdelta6 31.25 microgram pRV1 31.25 microgram pH21 1650 pl 2,5 M CaCl 2 12 ml dH 2 O In een klasse 2 weefselkweek kap steriel filter van de transfectie mengsel in een 50 ml buis. Terwijl vortexen de oplossing, snel toevoegen van 13 ml 2 x HEPES-gebufferde zoutoplossing (pH 7,05). Vervang de deksel van 50 ml buis en blijven vortex gedurende 15 seconden. Laten staan ​​gedurende 1 minuut 45 seconden, moet een fijne witte neerslag te vormen. Zachtjes voeg 5 ml van de transfectie oplossing voor elke 15 cm weefselkweek schotel. Swirl platen te mengen en terug te keren naar incubator. 16 uur na transfectie verwijderen IMDM medium en te vervangen door DMEM. 4. Lyseren van cellen en het oogsten van rAAVs (2 uur) 72 uur na transfectie, verwijder media uit celkweek platen en gooi deze weg. Al het afval dient te worden behandeld met Virkon oplossing of een ander geschikt desinfectans. Voorzichtig de cellen wassen in warm 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4). Voeg 25 ml warm PBS aan elk bord en verwijder voorzichtig cellen met een cel schraper. Verzamel suspensie in 50 ml buizen. Pellet cellen op 800 xg gedurende 10 minuten. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, gebruik van 10 ml per weefselkweek plaat. Opgesplitst in twee 50 ml buizen. Bereid een verse oplossing van 10% natriumdeoxycholaat in dH 2 O. Voeg 1,25 ml van deze aan elke buis voor een uiteindelijke concentratie van 0,5%. Voeg benzonase nuclease tot een uiteindelijke concentratie van 50 eenheden per ml. Meng grondig buis. <li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de cellulaire puin door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 15 minuten. Transfer naar verse 50 ml tube, ervoor zorgen dat alle celafval is verwijderd om te voorkomen dat het blokkeren van heparine kolommen (zie stap 5). In dit stadium kunnen de monsters worden bewaard bij -20 ° C voordat u verder gaat. Wij hebben opgeslagen monsters gedurende enkele weken bij -20 ° C zonder een vermindering van de besmettelijkheid. 5. Heparine kolom zuivering van rAAVs (2 – 3 uur) Setup HiTrap heparine kolommen met behulp van een peristaltische pomp, zodat oplossingen stroming door de kolom van 1 ml per minuut voor de stappen die 5,2 tot 5,4. Het is belangrijk om te controleren of er geen luchtbellen worden ingebracht in de heparine kolom. Evenwicht van de kolom met 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Van toepassing zijn 50 ml virus oplossing naar kolom en laat doorstromen. Was kolom met 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Met behulp van een 5 ml spuit blijft de kolom w wassenet 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, gevolgd door 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Gooi de flow-through. Met behulp van 5 ml spuiten en lichte druk elueren van het virus uit de kolom door het toepassen van: 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 Verzamel deze in een 15 ml centrifugebuis. 6. Concentratie en steriele filtratie van rAAVs (1 uur) Concentreer je vector met behulp van Amicon ultra-4 centrifugaal filter units met een moleculair gewicht 100.000 cutoff. Laad 4 ml eluaat van de kolom in de concentrator en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 2 minuten (op kamertemperatuur). Gooi doorstroomsysteem en reload concentrator met de resterende virus oplossing en herhaal centrifugeren. De geconcentreerde volume moet ongeveer 250 ul worden. Als geconcentreerde volume is aanzienlijk meer dan dit, gooi de stroom through en blijven centrifuge in een minuut stappen tot het volume is ongeveer 250 ul. Voeg 250 ui PBS om virus voor een eindvolume van 500 pi en verwijderen van de concentrator. Filter vector door middel van een 13 mm doorsnede 0,2 micrometer spuitfilter. Vector moet gealiquoteerd en bewaard bij -80 ° C tot de gewenste. 7. Titering van virale voorraden (3 dagen) Dit vereist een promotor die actief is in HEK293 cellen besturen van een reportergen of een immunocytochemically detecteerbaar genproduct. Bij het produceren van een vector die niet compatibel is met HEK293 cellen andere cellijnen of primaire celculturen worden gebruikt. Bereid 18 poly-L-lysine gecoat glas dekglaasjes of 18 putten van Nunc kamer dia's door zaaien HEK293 cellen, zodat deze zijn 40 – 50% confluent. Voor de titratie van Cre-afhankelijke rAAVs gebruiken HEK293 cellen die stabiel uitdrukken Cre recombinase 2. Infecteren elk putje met een seriële dilutions van de AAV-vector (afb. 2A). Gebruik 3 putten per verdunning. We routinematig direct toe te voegen virus aan elke well. Na 72 uur vast HEK293 cellen door het toevoegen van een gelijk volume van 4% paraformaldehyde (PFA) tot middelgrote (het geven van een uiteindelijke concentratie van 2% PFA) gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen drie keer in PBS, spoelen in dH 2 O en dekglaasje aan. Tel het aantal getransduceerde cellen van de drie putten die de hoogste verdunning factor hebben, maar bevatten nog steeds geïnfecteerde cellen, vind het gemiddelde van deze en vermenigvuldigen met de verdunningsfactor om het aantal infectieuze eenheden per microliter (Fig 2B) te geven. 8. Verwachte resultaten HEK293 cellen getransduceerd met een virus dat codeert voor versterkt groen fluorescent eiwit (eGFP) zijn weergegeven in figuur 2B. Wij over het algemeen een consistente titers van ongeveer 6 x 10 6 infectieuze deeltjes per micro liter. We routinematig gebruik van deze vectoren voor stereotaxische injectie in de volwassen knaagdieren hersenen. Dit zorgt voor een krachtige techniek voor de regio-specifieke genexpressie 2. Naar deze regio specificiteit te combineren met cell-type selectieve genexpressie we Cre recombinase-afhankelijke rAAVs injecteren in doel gebieden van Cre-transgene muizen 2. Figuur 2C-E toont voorbeelden van stereotaxische injecties van Cre-afhankelijke rAAVs codering eGFP in verschillende gebieden van de hersenen van volwassen parvalbumin-Cre transgene muizen 3. Figuur 1. Schematische weergave van het protocol voor rAAV productie. 1.) HEK293 cellen worden uitgeplaat en gekweekt tot 70 – 80% samenvloeiing. 2.) AAV en helper plasmiden worden voorbereid en getransfecteerd in HEK293 cellen. 3.) Medium is terug veranderd naar DMEM 16 uur na transfectie en HEK293 cellen worden gekweekt voor een ander 56 uur. 4.) HEK293 cellen geoogst en gelyseerd. rAAV vectoren zijn gescheiden van celresten door centrifugation. 5.) Virale deeltjes worden gezuiverd door middel van heparine kolommen voordat de concentratie en sterilisatie. 6.) HEK293 cellen worden gekweekt op 24 goed platen en met seriële verdunningen van de AAV-vector om het aantal infectieuze eenheden te bepalen infecteren. Figuur 2. Titering en in vivo toepassing van rAAV1 / 2. (A) Instellen van HEK293 cellen voor het meten van virale titer. HEK293 cellen zijn getransduceerd met seriële verdunningen van rAAVs. C, niet-geïnfecteerde controle; N, 1 ui van onverdunde virale voorraad. (B) HEK293 cellen geïnfecteerd met rAAVs uiten eGFP. (CE) Virale eGFP expressie is beperkt tot Cre expressie neuronen in verschillende doelgroepen regio's van parvalbumin-Cre transgene muizen na stereotaxische injectie van Cre-geactiveerde rAAVs. Voorbeelden beelden tonen GFP immunoreactiviteit in (C) van de thalamus en reticulaire globus pallidus, (D) de dentate gyrus en (E) de CA1 regio van de hippocampus. DG, dentate gyrus, RT, reticulaire thalamus kern; GP, globus pallidus. Schaal bars: B, 500 micrometer, C, 100 micrometer, D, 100 micrometer, E, 500 pm.