Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3'UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

Introdução MicroRNAs surgiram como importantes reguladores da expressão de genes que modulam a atividade de muitos processos biológicos importantes. Com mais de 700 miRNAs humanos identificados até agora 1, não é surpreendente que as mutações e regulação inadequada de miRNAs têm sido associados a uma variedade de desordens fisiológicas, tais como câncer e doenças cardíacas 2,3. Estudos recentes têm mostrado que a maioria dos miRNA reguladoras locais de ligação são encontrados em 3'UTRs 4,5, e alguns pesquisadores estimam que há centenas de alvos por miRNA na célula 6. Dada a importância biológica dos miRNAs, o grande número de miRNAs que existem e do grande número de alvos para cada um deles, é fundamental que os pesquisadores são capazes de identificar com segurança as metas endógena de miRNAs, preferencialmente em plataformas passíveis de high-throughput estudos. Enquanto utiliza ferramentas computacionais como miRBase, TargetScan e PicTar 1,6,7 é uma maneira poderosa para gerar listas de alvos para qualquer mRNA putativo miRNA, as previsões ainda não são precisas o suficiente para ser invocada, por si só 8. Portanto, os pesquisadores também aproveitar uma série de abordagens experimentais para identificar alvos de novo ou para validar as metas previstas. Muitas equipes têm contado com alto rendimento medidas de níveis de steady-state mRNA ou da proteína para identificar genes de expressão que muda quando a atividade miRNA é perturbado 4,9,10. Tais mudanças são, sem dúvida, biologicamente significativos e representam um primeiro passo importante, no entanto medir mudanças na expressão geral não faz distinção entre os efeitos direto de um miRNA em uma transcrição e indiretos ou a jusante efeitos de sinalização. Outras ferramentas poderosas que fornecem evidência direta de miRNA-mRNA interações são cromatina-imunoprecipitação (CHIP) estratégias que as proteínas cross-link Argonaute (e, portanto, o complexo RISC) para miRNAs e mRNAs, apesar de identificar os parceiros interagindo não indicar imediatamente os efeitos funcionais de tal evento uma ligação 5,11. Assim, 3'UTR repórter-ensaios que fornecer provas funcionais para efeito de miRNA sobre uma UTR particular, se tornaram um componente importante de um estudo minucioso miRNA. Esses dados baseados em células de ensaio em conjunto com as previsões alvo computacional ou expressão e de dados de proteômica fornece fortes evidências de que um 3'UTR particular é regulada diretamente pelos miRNA de interesse. Em um ensaio 3'UTR-repórter, a 3'UTR de um gene de interesse é fundida ao final de um gene repórter luciferase. Se o 3'UTR é um alvo de um miRNA, a estabilidade transcrição repórter e / ou a sua eficiência tradução vai mudar com a variação na concentração de miRNA funcional. Portanto, ao contrário transcrição somente ensaios com base, ensaios repórter ajudar a identificar os efeitos de ambos os mRNA estado estacionário e os níveis de proteína. Sistemas de repórter também pode ser usado para estudar os efeitos funcionais do mutagenizing um site putativo miRNA obrigatório em um 3'UTR para confirmar que é realmente necessário para o interaction8. E, embora estudos de grande escala utilizando matrizes de expressão, técnicas de proteômica e ChIP Argonaute fornecer valiosas do genoma de dados para um pequeno número de condições experimentais, ensaios baseados em células repórter são os mais propícios para a ampliação para o estudo de miRNA-3 ' interações UTR em centenas ou milhares de condições que possam ser necessários para high-throughput screening de moléculas pequenas ou outra biblioteca baseada efetores. Muitos cientistas têm tecnologia aplicada ensaio repórter para o estudo de miRNA 3'UTR interações. No entanto, com a idéia de que cada miRNAs muitas centenas alvo de transcrições diferentes, tem sido difícil para os pesquisadores a utilizar esta poderosa abordagem em uma escala de alto rendimento, porque a clonagem, validação, otimização e passos para a criação de milhares de diferentes 3'UTR- vetores repórter são muitas vezes um custo proibitivo. Em um esforço para fazer de pequeno e grande escala 3'UTR repórter estudos acessível a qualquer pesquisador, criamos uma coleção de todo o genoma de 3'UTRs humana pré-clonados no altamente otimizado sistema de análise lightswitch luciferase. O sistema também inclui repórter vetores de controlo validados, um conjunto de mais de 700 construções sintéticas miRNA-alvo repórter para uso como controles positivos, e uma série de protocolos experimentais padronizados. Usando o protocolo a seguir, você pode perguntar se uma 3'UTR humana particular é um alvo do seu miRNA de interesse. Os passos críticos neste fluxo de trabalho são de design experimental, transfecção de construções de repórter e imita miRNA, ensaios repórter luciferase, e análise de dados. Para o projeto experimental, é importante selecionar cuidadosamente uma linha celular transfectable, constrói repórter experimental e controle, e imita miRNA e não-alvo controla. Comuns altamente transfectable adhlinhagens de células erent como HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, e outros muitas vezes trabalham bem com esse protocolo. Notas importantes sobre design experimental O Sistema lightswitch ensaio de luciferase é um sistema totalmente otimizado repórter que inclui construções GoClone utilizando o gene RenSP luciferase e Reagentes Assay lightswitch luciferase. Use todos os componentes do Sistema lightswitch como recomendado para obter os resultados do ensaio ótimo repórter. Co-transfecção de qualquer oligos / plasmídeos com construções repórter Painéis GoClone reduz geral sinais luciferase de forma não-específicas. Portanto, é importante realizar as combinações de transfecção seguinte: único repórter repórter, + não-alvo miRNA controle, e repórter + miRNA específico. Nosso vetor empty_3UTR (promotor forte, não UTR) fornece um nível muito alto de sinal luciferase e serve como um controle positivo para a eficiência de transfecção e um sintético miRNA vector repórter alvo pode servir como um controle positivo para imitar a atividade. Além disso, recomendamos o uso do GoClone controles limpeza 3'UTR e controles aleatórios para separar com precisão seqüência específica contra efeitos não-específicos. Estudar o seu protocolo e sempre que possível tornar mestre mistura para diminuir a variabilidade em seus dados devido a erro de pipetagem ou evaporação. Este protocolo utiliza reagentes de transfecção DharmaFect Duo (Dharmacon). 1 dia DICA IMPORTANTE: Escolha a sua linha de celulares com sabedoria. Para melhores resultados, use uma linha de células que é conhecido por ser transfectable. Temos também descobriu que a resposta mensurável de um repórter UTR 3 'a um miRNA imitar é atenuada em linhagens de células com altos níveis endógenos de que miRNA particular. Se você não sabe o quanto miRNA sua linha de celulares expressa, tente alvo SGG do microRNA sintético que mede indiretamente a abundância de um miRNA em particular em uma célula, bem como informá-lo quanto à faixa dinâmica de seu ensaio. 1. Células de semente para produzir confluência ≥ 80% no momento da transfecção. Células de semente em uma placa de 96 poços TC branco no volume total 100μl. Nas sementes, em paralelo o número adequado de células em um prato claro de 96 poços para avaliar a confluência. DICA IMPORTANTE 1: Confluence é fundamental para atingir bons resultados em um experimento de imitar. Para knockdown ideal, as células devem ser 100% confluente no momento da transfecção. DICA IMPORTANTE 2: Usar células passagem baixo para melhores resultados. Células que foram várias passagens muitas vezes tendem a produzir dados transfecção ruidosos. Dia 2 Prepare constrói GoClonereporter miRNAs e, em seguida, transfecção nas células confluentes. 2. Prepare Constrói Descongelar constrói GoClone (DNA plasmídeo) em temperatura ambiente. Misture bem. Centrífuga para remover a condensação da tampa. 3. Prepare RNAs Micro MicroRNAs Thaw (imita específicas e não-alvo controles) em temperatura ambiente e centrifugar para remover a condensação das tampas. Diluída para uma concentração de trabalho de 2 M em água livre de RNase. Além de um miRNA experimental imitar sempre incluir um controle de miRNA não-alvo. Co-transfecting um plasmídeo e um pequeno RNA oligo leva a um menor sinal de que o plasmídeo transfecting sozinho. Incluir um ou mais controlos positivos. Considere usar uma das centenas de vetores sintéticos miRNA-alvo repórter no catálogo da SGG. Incluir um ou mais controles negativos ou não-específicas. SGG tem uma gama de controles, incluindo UTRs 3 'de genes housekeeping, fragmentos aleatórios e / ou o controle (sem inserir UTR) vazio. O uso de um ou mais desses controles ao lado de uma construção experimental permitirá que você normalize para todos os efeitos não-específicos atribuíveis à superexpressão de sua miRNA específico ou o controle não-alvo. 4. Prepare Transfections Para cada transfecção combinar os seguintes reagentes para um único ensaio: Mistura 1 Repórter GoClone individuais: 3,33 mL microRNA: Varia * Sem soro de mídia: a 10 mL * Concentração efetiva miRNA pode variar de 10 nM-100 nM. Consulte o fabricante miRNA para a concentração adequada. DICA IMPORTANTE: Não adicione muito imitar. Uma gama razoável para imitar concentrações é 10-50 nM na reação final 100uL. Realizar pelo menos três réplicastransfections te para cada tratamento / combinação UTR e incluem volume adicional para permitir a pipetagem erro. Por exemplo, multiplicar o volume de reação única de 3,5 para obter mix transfecção suficiente para três poços transfecção replicar incluindo extra para pipetagem de erro ou a evaporação. Para cada repórter, configurar repetições para o seguinte: o repórter só repórter, + não-direcionamento e controle de miRNA repórter + miRNA específico. Configurar transfections para o microRNA visando ao mesmo tempo, como os de um controle não-alvo. Compõem o DUO DharmaFECT mistura (Dharmacon) como segue para cada transfecção: Mistura de 2 DharmaFect Duo: 0,15 mL Soro de mídia livre: 9,85 mL A quantidade de DharmaFECT Duo a ser adicionada pode ser linha celular dependente. Os montantes acima indicados são apropriados para HT1080 células. Consulte a documentação do fabricante para determinar a quantidade adequada para a sua linha de celular. Dica: Faça uma mistura de transfecção grandes multiplicando os volumes acima pelo número de repórteres, o número de repetições e do número de miRNAs a ser testado. Ao calcular a quantidade de mistura de transfecção de preparar, não se esqueça de incluir uma pequena quantidade extra para contabilizar os erros de pipetagem e evaporação. Deixe a mistura Duo DharmaFECT para incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Após 5 minutos, adicionar 10μL da mistura Duo DharmaFECT (Mistura 2) a cada tubo preparada de 10uL plasmídeo e / ou miRNA (Mistura 1). Cada tubo deve então conter um volume de 20μL por transfecção replicar. Incubar cada mistura por 20 minutos em temperatura ambiente. Após 20 minutos, adicionar 80 mL do pré-aquecido (37 ° C), livre de antibióticos, a mídia completa por repetição a cada tubo para um total de 100μL por transfecção replicar. Um bloco de poços profundos pode ser usado para a preparação de muitas repetições e amostras simultaneamente. Misturar a solução pipetando cima e para baixo. Remova a placa semeada da incubadora. Verificar que as células são pelo menos 80% confluentes. Cuidadosamente pipeta fora da mídia de cada poço. Adicionar 100μL da mistura de transfecção (20uL DNA / reagente mix + 80uL media) a cada poço. Colocar a placa na incubadora durante a noite. Não excesso de incubar. Mais imita irá produzir resultados significativos em bona fide alvos dentro de 24 horas. O nível de repressão mensuráveis ​​em 48 horas pode ser maior, mas assim que o bem a variabilidade bem. Mimic experimentos são mais fáceis do que as experiências inibidor. Enquanto a maioria imita significativamente reprimir os verdadeiros alvos dentro de 24 horas, significativas de repressão atribuíveis ao inibidor pode demorar 48 horas para ser mensuráveis ​​e será quase sempre menos pronunciada do que o efeito da mímica. Dia 3 Nota: ensaios de luciferase podem ser realizados imediatamente, ou as placas podem ser congeladas a -80 ° C (congelamento geralmente aumenta a lise celular e sinal luciferase). Congelar e descongelar as suas células antes assaying para melhores resultados. LEMBRE-SE para deixar descongelar células congeladas à temperatura ambiente antes de adicionar lightswitch Reagente de Ensaio. 5. Atividade medida luciferase com lightswitch AssayReagents Retire a placa da incubadora e trazer à temperatura ambiente. Prepare os reagentes do ensaio lightswitch (para kit LS010, protocolos de tamanhos kit outras podem ser encontradas on-line): Substrato reconstituir 100X adicionando 100μL de substrato de solvente para tubo de ensaio de substrato liofilizado. Proteger da luz e minimizar o tempo em temperatura ambiente. Substrato 100X podem ser armazenadas a-20C por 2-3 semanas. Para melhores resultados, use substrato acaba de ser reconstituído. Preparar a solução de Ensaio pelo descongelamento frasco 10ml de Tampão de Ensaio em sala de banho de água de temperatura e adicionar 100μL de substrato 100X reconstituído antes da utilização. Misture bem. Use uma pipeta multi-canal para adicionar 100μL da solução de Ensaio lightswitch (buffer + substrato) diretamente para cada poço de amostra (contendo 100uL células + media) em uma placa branca de 96 poços. Se as células foram cultivadas em outra placa ou formato de frasco, as amostras de transferência para uma placa branca de 96 poços em volume total 100μL (mídia ou PBS). Placa de cobertura, proteger da luz, e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Assaying Se mais de uma chapa, cambaleiam adição da solução de ensaio, para que cada placa incuba por 30 minutos antes da leitura. Leia cada poço por 2 segundos em uma placa luminometer (SpectraMax L ou equivalente). Calcular o knockdown, calculando relação sinal luciferase para cada construção de miRNA específicas sobre o controle não-alvo (luminescência = miRNA específico / não-alvo de controle). Use os dados do serviço de limpeza, aleatório, e constrói vazia para controlar para não-UTR efeitos do tratamento específico. Resultados representante 3'UTR alvos na presença de um miRNA visando mostrar knockdown luciferase. O knockdown da 3'UTR-luciferase atividade repórter por deixá-7a foi medida em células HT1080 por co-transfecting 100ng de cada repórter construir com 20nm controle imitam ou não de metas de let-7, incubando durante 24 horas, depois de ler o repórter luminescentes sinal usando os reagentes do ensaio lightswitch luciferase. Figura 1. Punção e ARID3B 3'UTRs humanos são alvos do microRNA let-7. Sinais dos repórteres 3'UTR humanos para a punção e genes ARID3B são significativamente derrubado na presença do microRNA let-7 imitar enquanto os sinais de limpeza e seqüência aleatória UTRs não são.