تحديد الأهداف من microRNAs الإنسان مع نظام الفحص LightSwitch Luciferase به مراسل 3'UTR - a يبني وmicroRNA مقلد في خلايا منتسب

مقدمة كما ظهرت MicroRNAs المنظمين هامة في التعبير الجيني التي تعدل من نشاط العديد من العمليات البيولوجية الهامة. مع أكثر من 700 miRNAs الإنسان تم تحديدها حتى الآن 1 ، فإنه ليس من المستغرب أن ارتبطت طفرات والتنظيم غير الملائم للmiRNAs لمجموعة متنوعة من الاضطرابات النفسية مثل السرطان وأمراض القلب 2،3. وقد أظهرت الدراسات الحديثة التي تم العثور عليها في معظم المواقع التنظيمية ميرنا ملزم في 3'UTRs 4،5 ، ويقدر بعض الباحثين أن هناك المئات من الأهداف في ميرنا في الخلية 6. نظرا للأهمية الحيوية لmiRNAs ، وعدد كبير من miRNAs موجودة والعدد الكبير من الأهداف لكل منهما ، فمن الأهمية بمكان أن الباحثين قادرون على تحديد الأهداف بشكل موثوق الذاتية للmiRNAs ، ويفضل على منصات قابلة للدراسات عالية الإنتاجية. مع استخدام الأدوات الحسابية مثل miRBase ، TargetScan وPicTar 1،6،7 هو وسيلة قوية لتوليد قوائم الأهداف مرنا المفترضة لأي ميرنا ، والتوقعات لا تزال غير دقيقة بما يكفي ليمكن الاعتماد عليها وحدها 8. ولذلك ، والباحثين الاستفادة أيضا عددا من المناهج التجريبية لتحديد الأهداف من جديد أو للتحقق من الأهداف المتوقعة. وقد اعتمدت العديد من الفرق على الإنتاجية العالية تدابير لمستويات البروتين مرنا أو حالة ثابتة لتحديد الجينات التي التغييرات التعبير عندما ميرنا النشاط هو مضطرب 4،9،10. مثل هذه التغييرات هي بلا شك ذات مغزى من الناحية البيولوجية ، وتمثل خطوة أولى مهمة ، لكن قياس التغيرات في التعبير عموما لا يميز بين الآثار المباشرة لميرنا على نص والآثار غير المباشرة أو المصب الإشارة. الأدوات القوية الأخرى التي تقدم الدليل على التفاعلات ميرنا ، مرنا المباشرة الكروماتين مناعي (رقاقة) الاستراتيجيات التي البروتينات argonaute عبر الارتباط (وبالتالي معقدة RISC) لmiRNAs و mRNAs ، على الرغم من تحديد الشركاء التفاعل لا يدل على الفور الآثار الفنية لمثل هذا الحدث ملزمة 5،11. وبالتالي ، أصبحت 3'UTR – مراسل المقايسات التي توفر الأدلة الفنية لإحداث ميرنا وعلى وجه الخصوص UTR عنصرا هاما لدراسة ميرنا شامل. مثل هذه البيانات على أساس مقايسة الخلايا مجتمعة مع التوقعات المستهدفة الحسابية أو التعبير والبيانات البروتيوميات يوفر دليلا قويا على أن يخضع مباشرة 3'UTR سيما من جانب ميرنا المصالح. في مقايسة 3'UTR ، مراسل ، وتنصهر في 3'UTR من الجينات التي تهم نهاية الجين مراسل luciferase. إذا 3'UTR هو الهدف من ميرنا ، فإن الاستقرار مراسل نص و / أو كفاءتها ترجمة التغيير مع اختلاف في التركيز ميرنا وظيفية. ذلك خلافا لنص فقط ، المقايسات مقرها ، المقايسات مراسل تساعد في تحديد التأثيرات على حد سواء مرنا حالة مستقرة ومستويات البروتين. ويمكن أيضا أن تستخدم نظم مراسل لدراسة الآثار الفنية للموقع mutagenizing ميرنا المفترضة في 3'UTR ملزمة للتأكد من أنه هو في الواقع ضروري لinteraction8. وعلى الرغم من الدراسات على نطاق واسع باستخدام صفائف التعبير ، وتقنيات تحليل البروتينات ، ورقاقة argonaute توفير قيمة الجينوم على نطاق بيانات لعدد قليل من الظروف التجريبية ، المقايسات خلية مقرها مراسل هم الأكثر قابلية لرفع مستوى لدراسة 3 ميرنا ' قد التفاعلات UTR في مئات أو آلاف من الشروط اللازمة لتصبح على النحو الفرز الفائق الإنتاجية من جزيئات صغيرة أو غيرها من المستجيبات المكتبة مقرا لها. وقد طبقت العديد من العلماء مراسل التكنولوجيا مقايسة لدراسة ميرنا – 3'UTR التفاعلات. ومع ذلك ، مع الفكرة القائلة بأن العديد من miRNAs كل هدف مئات من النصوص المختلفة ، فقد كان من الصعب على الباحثين للاستفادة من هذا النهج قوية على نطاق والإنتاجية العالية لأن الاستنساخ ، والمصادقة ، والتحسين خطوات لخلق الآلاف من مختلف 3'UTR – مراسل ناقلات من حيث التكلفة الباهظة في كثير من الأحيان. في محاولة لجعل الصغيرة والكبيرة الحجم ، 3'UTR مراسل الدراسات في متناول أي باحث ، وقد انشأنا مجموعة واسعة من الجينوم البشري 3'UTRs قبل المستنسخة في نظام عالي الكفاءة LightSwitch Luciferase الفحص. النظام يشمل أيضا ناقلات مراسل تحكم التحقق من صحة ، ومجموعة من أكثر من 700 بنيات تركيبية ميرنا مراسل المستهدفة لاستخدام والضوابط الإيجابية ، وسلسلة من البروتوكولات التجريبية موحدة. باستخدام بروتوكول التالية ، يمكنك أن تسأل ما إذا كان الإنسان هو 3'UTR خاص هدفا لميرنا اهتمامك. خطوات حاسمة في هذا العمل والتصميم التجريبي ، ترنسفكأيشن بنيات مراسل ويحاكي ميرنا ، المقايسات مراسل luciferase ، وتحليل البيانات. لتصميم تجريبي ، فمن المهم تحديد مدروس خط خلية transfectable ، يبني مراسل التجريبية والسيطرة ، ويحاكي ميرنا والضوابط غير الاستهداف. مشتركة عالية transfectable ADHمثل خطوط الخلايا erent HepG2 ، HT1080 ، HCT – 116 ، الحله ، 293 ، وغيرهم غالبا ما تعمل بشكل جيد مع هذا البروتوكول. ملاحظات هامة على تصميم تجريبي نظام الفحص LightSwitch Luciferase هو نظام مراسل الأمثل تماما أن يتضمن ثوابت GoClone باستخدام الجينات RenSP luciferase والكواشف LightSwitch Luciferase الفحص. استخدام كافة مكونات النظام LightSwitch على النحو الموصى به للحصول على أفضل نتائج الفحص المراسل. شارك في ترنسفكأيشن أي oligos / البلازميدات مع ثوابت مفاتيح مراسل GoClone يقلل إشارات luciferase عموما بطريقة غير محددة. لذا ، فمن المهم لتنفيذ تركيبات ترنسفكأيشن التالية : المراسل فقط ، مراسل + عدم استهداف ميرنا السيطرة ، ومراسل + ميرنا محددة. ناقلات لدينا empty_3UTR (مروج قوية ، لا UTR) على مستوى عال جدا من إشارة وluciferase بمثابة مراقبة إيجابية لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن ، وهدفا ميرنا الاصطناعية ناقلات المراسل قد تكون بمثابة مراقبة إيجابية للتقليد النشاط. بالإضافة إلى ذلك ، نوصي باستخدام التدبير المنزلي 3'UTR GoClone الضوابط والضوابط عشوائي ليفصل بدقة تسلسل محدد مقابل الآثار غير محددة. دراسة البروتوكول الخاص ، وكلما كان ذلك ممكنا جعل يمزج الرئيسي لتقليل التباين في البيانات الخاصة بك بسبب خطأ pipetting أو التبخر. هذا البروتوكول يستخدم كاشف DharmaFect ترنسفكأيشن ديو (Dharmacon). اليوم 1 TIP هام : اختر خط صومعتك بحكمة. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم خط الخلية التي من المعروف عنها أنها transfectable. وقد وجدنا أيضا أن الاستجابة للقياس مراسل UTR 3 'إلى ميرنا تقليد هو الموهن في خطوط الخلايا مع مستويات عالية من الذاتية التي ميرنا معينة. إذا كنت لا تعرف كيف ميرنا كثيرا عن خط الخليوي ، في محاولة لاستهداف SGG microRNA الاصطناعية التي تقيس بشكل غير مباشر على وفرة من ميرنا معين في الخلية وكذلك تخبرك فيما يتعلق النطاق الديناميكي للفحص الخاص بك. 1. خلايا لانتاج البذور التقاء ≥ 80 ٪ في وقت ترنسفكأيشن. خلايا البذور في 96 – TC جيدا لوحة بيضاء في إجمالي حجم 100μl. في البذور ، وبالتوازي مع العدد المناسب من الخلايا في لوحة واضحة 96 – جيدا لتقييم التقاء. TIP هام 1 : التقاء هو المفتاح لتحقيق نتائج جيدة في تجربة تحاكي. ضربة قاضية للالمثلى ، يجب أن تكون 100 ٪ خلايا متكدسة في وقت ترنسفكأيشن. IMPORTANT TIP 2 : استخدام خلايا مرور منخفض للحصول على أفضل النتائج. الخلايا التي تم passaged مرات كثيرة جدا تميل إلى العائد البيانات ترنسفكأيشن صاخبة. اليوم 2 إعداد ويبني GoClonereporter miRNAs ، transfect ثم إلى خلايا متموجة. 2. إعداد التركيبات يبني GoClone ذوبان الجليد (DNA البلازميد) في درجة حرارة الغرفة. مزيج جيد. أجهزة الطرد المركزي لإزالة التكثيف من الغطاء. 3. إعداد الرناوات مايكرو microRNAs ذوبان الجليد (يقلد وضوابط محددة غير الاستهداف) في درجة حرارة الغرفة وجهاز الطرد المركزي لإزالة التكثيف من القبعات. تمييع إلى تركيز العمل من 2 ميكرومتر في ريبونوكلياز خالية من المياه. بالإضافة إلى ميرنا تجريبية تحاكي تشمل دائما السيطرة ميرنا غير الاستهداف. شارك في transfecting البلازميد والصغيرة بنسبة ضئيلة الحمض النووي الريبي يؤدي إلى انخفاض في إشارة من transfecting البلازميد وحدها. وتشمل الضوابط واحد أو أكثر إيجابية. النظر في استخدام واحدة من مئات من ناقلات الاصطناعية ميرنا مراسل الهدف في الكتالوج SGG ل. وتشمل الضوابط واحد أو أكثر سلبية أو غير محددة. SGG لديها مجموعة من الضوابط بما في ذلك UTRs 3 'من الجينات التدبير المنزلي ، وشظايا عشوائية و / أو التحكم فارغة (لا يوجد إدراج UTR). سيتم استخدام واحد أو أكثر من هذه الضوابط جنبا إلى جنب مع بناء التجريبية تسمح لك لتطبيع لأية آثار غير محددة تعزى إلى overexpression من ميرنا معينة أو مراقبة عدم استهداف. 4. إعداد Transfections لكل ترنسفكأيشن الجمع بين الكواشف التالية لفحص واحد : خليط 1 فرد GoClone مراسل : 3.33 ميكرولتر microRNA : يختلف * مصل خالية من وسائل الإعلام : إلى 10 ميكرولتر * يمكن التركيز الفعال لميرنا تختلف من نانومتر NM – 100 10. ميرنا استشارة الشركة المصنعة لتركيز مناسبة. TIP IMPORTANT : لا إضافة الكثير من تقليد. مجموعة معقولة لتقليد تركيزات 10-50 نانومتر في رد فعل 100uL النهائي. أداء لا يقل عن ثلاثة المتماثلةtransfections الشركة المصرية للاتصالات عن كل معاملة / تركيبة UTR وتشمل الحجم الإضافي للسماح pipetting الخطأ. على سبيل المثال ، مضاعفة حجم رد الفعل واحد بنسبة 3.5 في الحصول على ما يكفي من المزيج لمدة 3 ترنسفكأيشن ترنسفكأيشن الآبار بما في ذلك نسخ اضافية لpipetting خطأ أو التبخر. لكل صحافي ، وإنشاء نسخ متماثلة من أجل ما يلي : المراسل فقط ، مراسل + عدم استهداف الصحفيين والسيطرة ميرنا ميرنا + معينة. إعداد transfections لاستهداف microRNA في نفس الوقت مثل تلك لمراقبة عدم استهداف. تشكل DUO DharmaFECT (Dharmacon) الخليط على النحو التالي لكل ترنسفكأيشن : خليط 2 DharmaFect الثنائي : 0.15 ميكرولتر المصل وسائل الإعلام الحرة : 9.85 ميكرولتر قد يكون مقدار ديو DharmaFECT تضاف يكون خط الخلية التابعة. المبالغ المشار إليها أعلاه هي مناسبة لHT1080 الخلايا. راجع وثائق الشركة المصنعة لتحديد المبلغ المناسب للخط الخلوي. نصيحة : اصنع خليط ترنسفكأيشن كبيرة بضرب كميات أعلاه من قبل عدد من الصحفيين ، وعدد من يعيد ويمكن اختبار عدد من miRNAs. عند حساب كمية مزيج ترنسفكأيشن للتحضير ، ومن المؤكد أن تشمل كمية صغيرة اضافية لحساب pipetting الأخطاء والتبخر. السماح للخليط الثنائي DharmaFECT لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، إضافة 10μL من خليط الثنائي DharmaFECT (خلطة 2) لكل أنبوب المعدة لل10uL و / أو ميرنا البلازميد (الخلطات 1). وينبغي أن تحتوي على كل أنبوب ثم بلغ حجم التداول في 20μL ترنسفكأيشن تكرار. احتضان كل الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 دقيقة ، وإضافة 80 ميكرولتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) ، ووسائل الإعلام ، والمضادات الحيوية خالية كاملة في كل أنبوب تكرار لما مجموعه 100μL في ترنسفكأيشن تكرار. ويمكن استخدام كتلة العميقة جيدا لإعداد العديد من العينات ويعيد في نفس الوقت. مزيج الحل بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. إزالة لوحة المصنفة من الحاضنة. تحقق من أن الخلايا لا يقل عن 80 ٪ متموجة. الماصة قبالة بعناية وسائل الإعلام من كل بئر. إضافة 100μL من خليط ترنسفكأيشن (20uL الحمض النووي / كاشف مزيج + 80uL وسائل الإعلام) على كل جانب. لوحة في مكان حاضنة بين عشية وضحاها. لا الإفراط في احتضان. ومعظم انتاج يحاكي نتائج هامة على أهداف حسنة النية في غضون 24 ساعة. يجوز للمستوى القمع في 48 ساعة قابلة للقياس تكون أكبر ، ولكن ذلك سوف البئر لتقلب جيدا. تقليد تجارب أسهل من التجارب المانع. في حين أن معظم يحاكي سوف تقمع بشكل كبير الأهداف الحقيقية في غضون 24 ساعة ، يمكن كبيرة دي القمع التي تعزى إلى مثبط تأخذ 48 ساعة لتكون قابلة للقياس ، وسوف يكون دائما تقريبا أقل وضوحا من تأثير تقليد. اليوم 3 ملاحظة : يمكن إجراء فحوصات Luciferase فورا أو قد تكون مجمدة في لوحات -80 درجة مئوية (تجميد الزيادات عموما تحلل الخلايا وإشارة luciferase). تجميد والذوبان خلايا الخاص بك قبل معايرة للحصول على أفضل النتائج. تذكر للسماح للخلايا مجمدة ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة قبل ان يضيف LightSwitch الكاشف الفحص. 5. قياس النشاط luciferase مع AssayReagents LightSwitch إزالة لوحة من الحاضنة وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة. إعداد الكواشف الفحص LightSwitch (لLS010 عدة ، يمكن العثور على عدة بروتوكولات من الأحجام الأخرى عبر الإنترنت) : الركيزة إعادة 100X بإضافة 100μL من الركيزة بالمذيبات لأنبوب الفحص الركيزة مجفف بالتجميد. يحفظ بعيدا عن الضوء وتقليل الوقت في درجة حرارة الغرفة. قد تكون مخزنة في الركيزة 100X – 20C ل3weeks – 2. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم الركيزة المعاد حديثا. تحضير محلول الفحص من قبل ذوبان 10ML زجاجة من الاحتياطي الفحص في درجة حرارة الغرفة حمام الماء وإضافة 100μL من الركيزة 100X المعاد قبل الاستخدام. مزيج جيد. استخدام pipettor متعددة القنوات لإضافة محلول الفحص 100μL LightSwitch (العازلة الركيزة +) مباشرة إلى كل عينة جيدة (التي تحتوي على خلايا 100uL + وسائل الإعلام) في لوحة بيضاء 96 – جيدا ، وإذا ما نمت الخلايا في آخر لوحة أو شكل القارورة ، بنقل العينات لوحة بيضاء 96 – جيدا في إجمالي حجم 100μL (وسائل الإعلام أو PBS). لوحة الغلاف ، وحماية من الضوء ، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وإذا يعاير أكثر من لوحة ، وارباك إضافة محلول الفحص بحيث يكون لكل لوحة incubates لمدة 30 دقيقة قبل القراءة. قراءة كل جيدا لمدة 2 ثانية في لوحة وميnometer (L SpectraMax أو ما يعادلها). حساب ضربة قاضية من خلال حساب نسبة الإشارة luciferase لكل بناء لميرنا محددة حول السيطرة عدم استهداف (التلألؤ = ميرنا محددة / عدم استهداف التحكم). استخدام البيانات من التدبير المنزلي ، والعشوائية ، ويبني فارغة للسيطرة على الآثار غير UTR علاج محدد. ممثل النتائج 3'UTR أهداف في وجود ميرنا استهداف تظهر luciferase ضربة قاضية. تم قياس النشاط ضربة قاضية مراسل 3'UTR – 7A luciferase التي ترك في HT1080 الخلايا 100ng المشترك transfecting كل مراسل بناء مع 20nM السيطرة تقليد أو عدم استهداف اسمحوا – 7A ، يحتضنها لمدة 24 ساعة ، ثم قراءة مراسل الانارة إشارة باستخدام الكواشف LightSwitch Luciferase الفحص. الشكل 1. وPUNC ARID3B 3'UTRs الإنسان هي أهداف microRNA اسمحوا – 7A. اشارات من الصحفيين 3'UTR البشرية لPUNC والجينات هي ARID3B طرقت كثيرا عليها في وجود microRNA اسمحوا – 7A تقليد بينما إشارات للتدبير المنزلي وتسلسل عشوائي UTRs ليسوا كذلك.