修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析
Summary
植された細胞（幹神経堤細胞）の移行を解析するアプローチが説明されています。この方法は、安価な優しい、そのような主要なトランク神経堤細胞培養内細胞間相互作用に由来するもののような渡り鳥の極性にケモキネシスと他の影響の両方からの走化性を区別することができる。
Abstract
神経堤細胞は（NCCS）上皮間葉移行1,2を経て神経管背側（NT）から移住している脊椎動物の発生中に存在する細胞の一時的な集団である。彼らは目標に到達するまで、EMTに続いて、NCCSは常の経路に沿って長い距離を移行します。 NCCSは、ニューロン、グリア細胞、メラノサイト、および1-3クロマフィン細胞を含む細胞型の広大な配列に分化する。それらの適切なターゲットの場所に到達し、認識するNCCSの能力はトランク部品3 NCC由来を含むすべての構造の適切な形成のための基礎的です。トランクNCCの移行のための指導のメカニズムを解明すること、したがって非常に重要な問題となっています。多数の分子がNCCの移行4を導くことが実証されている。たとえば、トランクNCCSは、セマフォリン、エフリン、スリットリガンド5月8日のような負の指導の手がかりではじかれることが知られている。ただし、いない最近までトランクNCCS任意の化学誘引物質は、9同定されている。
付着細胞の走化性行動の研究にvitroアプローチで、従来は不死化、均一に分布細胞で最適に動作しますが、最初は均一な分布を欠いており、急速に分化する（例えばNCCSなど）特定の主要な幹細胞培養物に適用することがより困難である。走化性研究のためにトランクNCCSの分布を均一化する一つのアプローチは、持ち上げると、それらはほぼ100％コンフルエントになるようにreplate次に、プライマリNTの外植培養からトランクNCCSを単離することである。しかし、このメッキのアプローチは、時間と労力のかなりの量が十分な細胞を植する必要が過酷であり、 インビボ条件下で見つかっに異なる方法でトランクNCCSを配布しています。
ここでは、requirinずにトランクNCCSの走化性および他の渡り鳥の応答を評価することがin vitroでのアプローチを報告GA均質な細胞分布。この手法は、修正Zigmondチャンバー（標準Zigmond室は別の場所で10記述されています）内部トランクNCCS乱れのない、原発のタイムラプスイメージングを利用しています。彼らの自然な方向性予測に垂直であるchemotactantグラデーションに文化の周縁部にトランクNCCSを公開することにより、適用されたchemotactant勾配によって誘起される渡り鳥極性の変化を検出することができる。この手法は、レプリケート処理あたり2つだけのNT外植片の培養を必要とする過酷な細胞リフティングを（例えばトリプシン処理など）を回避し、植と実験の間の時間が削減され、in vivo条件下でより同様の分布にトランクNCCSを残し、安価である（おそらく差別のリスクを軽減している）、および多数の渡り鳥の特性の経時的評価を可能にします。
Protocol
Discussion
トランクNCCSで走化性研究を実施することの理由のシリーズのためにやりがいがあると判明しました。トランクNCCSは、長期培養した場合と区別されます異種の幹細胞集団を構成しているので、トランクNCCSはトランクレベルのNTのプライマリ植から取得する必要があります。彼らが最初に細胞が単離され、均質に走化性チャンバー（例えば、ボイデンチャンバー12）に再播種されている?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、このメソッドの開発中に技術的な支援のためにリノキム、スティーヴ·グスマンとUjit Satyarthiに特別な感謝を与える。マイロン·ホーソーン、リチャードSpengel、ロベルト·ロハスは、ここで使用室を機械加工し、待望の技術支援を提供した。特筆すべきは、ロベルト·ロハスは、図4を産生した。我々はまた、上記の走化性アッセイの開発に先立っスコットフレイザーの貴重なアドバイスに感謝しています。本研究の一部はMEDBにNIHのMBRをのSCORE-5S06GM048680-13でサポートされているとCSUノースリッジ校大学院学位論文支援プログラムからCWに受賞をされました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
| Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
| Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
| Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
| L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
| Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
| Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
| Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
| Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
| Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
| Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
| Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
| Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
| Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
- Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
- Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
- Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
- Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
- Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
- Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
- Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
- Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
- Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.
Referenzen
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Baker, C. V. . Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).
- Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
- Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
- Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).
- De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells. The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells. J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chicken embryo. J. Morph. 88, 49-52 (1951).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Davis, E. M., Trinkaus, J. P. Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).
