LentiPlex بعثة مجمع shRNA الفرز مكتبة في خلايا الثدييات
Summary
هنا نستخدم مكتبة LentiPlex الإنسان المجمعة التقليدية وأساليب التسلسل الجيني لتحديد أهداف تعزيز بقاء الخلية. نحن لشرح كيفية إعداد وdeconvolute شاشة LentiPlex والتحقق من صحة النتائج.
Abstract
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو آلية جوهرية الخلوية لتنظيم التعبير الجيني. تسخير قوة فطرية لهذا النظام يتيح لنا ضربة قاضية لمستويات التعبير الجيني في فقدان دراسات وظائف الجينات.
هناك طريقتين رئيسيتين لأداء رني. الأولى هي استخدام الصغيرة RNAs والتدخل (siRNAs) التي تم توليفها كيميائيا ، والثاني يستخدم قصيرة القاسي الرناوات (shRNAs) المشفرة داخل البلازميدات 1. يمكن transfected الأخير في الخلايا مباشرة أو حزم جسيمات في تكرار lentiviral غير كفء. المزايا الرئيسية لاستخدام shRNAs lentiviral هو سهولة إدخالها في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، وقدرتهم على الاندماج في جينوم ثابت لفترة طويلة الأجل واختيار الجينات ضربة قاضية ، ومدى فعاليتها في إجراء عالية الإنتاجية من الشاشات فقدان الوظيفة. لتسهيل هذا وضعنا LentiPlex المجمعة shRNA المكتبة.
وMISسيون مكتبة LentiPlex shRNA الإنسان مجمع بركة الجينوم على نطاق lentiviral المنتجة باستخدام عملية الملكية. مكتبة يتكون من بنيات shRNA أكثر من 75،000 من الهيئة تستهدف جمع 15000 + 2 الجينات البشرية. يتم اختبار كل مكتبة للتمثيل shRNA قبل الافراج المنتج لضمان تغطية قوية المكتبة. وتقدم المكتبة في شكل جاهز للاستخدام في lentiviral التتر ما لا يقل عن 5 × 10 8 مل / TU عبر فحص P24 وقبل مقسمة إلى عشرة subpools حوالي 8000 shRNA يبني كل منهما. كما يتم توفير التضخيم وتسلسل الاشعال لتحديد الهدف المصب.
أثبتت الدراسات السابقة نشاط انتيتومور المتآزر لTRAIL عندما يقترن باكليتاكسيل A549 في الخلايا ، وسرطان الرئة الخلية البشرية السطر 3 ، 4. في هذه الدراسة تثبت أننا في تطبيق مكتبة LentiPlex shRNA المجمعة لإجراء سريعا شاشة اختيار إيجابية للجينات تشارك في السمسة سو A549 الخلايا عند تعرضها للتريل وباكليتاكسيل. حاجز واحد واجه كثير من الأحيان مع شاشات عالية الإنتاجية والتكلفة وصعوبة في deconvolution ، ونحن من التفصيل أيضا نهجا فعالا من حيث التكلفة النسائل المتعددة باستخدام التسلسل التقليدي.
Protocol
Discussion
في هذه الدراسة ، فإننا نقدم شاشة الجينوم واسعة لتحديد الجينات المسؤولة عن السمسة A549 من الخلايا التالية باكليتاكسيل / تريل العلاج. استخدام نهج المجمعة في شاشة الجينوم على نطاق يقلل من الوقت والتكلفة والاستثمار في المعدات التي ترتبط عادة مع الشاشات التقليدية التي تم حشدها. حاسمة بالنسبة لنجاح التجارب الشاشة هي الأمثل يؤديها سلفا. يجب أن تكون الظروف تنبيغ وزارة الداخلية تحدد تجريبيا.
وينبغي اختيار الأسلوب يسمح للاختيار من الخلايا القوية التي تعرض النمط الظاهري المطلوب (على سبيل المثال ، والبقاء التعبير سطح البروتين ، الخ). والاستفادة المثلى من هذه المعلمات تقليل عدد ايجابيات كاذبة الكشف عنها.
هنا ، كان حصادها gDNA من سكان الجزء الأكبر من الخلايا المحددة ثم TOPO المستنسخة لتحديد إدراج shRNA الفردية. كان من الممكن تحسين واحدة لهذه التجربة لتحديد الخلايا الحية لاستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لضمانيتم جمع إلا أن الخلايا الحية. وسيتم التحقق من الأهداف التي حددها تنبيغ مع shRNAs محددة الهدف في مقايسة الفرز. ويضرب عرض النمط الظاهري صحيحا في معظم الآبار.
مكتبة LentiPlex مجمع يتسم بالمرونة في تطبيقها. وهو متوافق مع مجموعة واسعة من التطبيقات المصب ، ويمكن استخدامها مع استراتيجيات الاختيار إما إيجابية أو سلبية. تبعا للظروف الفرز ، ويتم إنجاز deconvolution لإدراج shRNA عبر PCR / الاستنساخ ، ميكروأري ، أو الجيل القادم التسلسل 9 و 10 وبينما هو راسخ في قوة وسرعة من هذه التقنيات لdeconvolute شاشات رني ، واحدة مع القلق وميكروأري الجيل القادم من أساليب التسلسل هو توافر الموارد المعلوماتية الحيوية والمعارف اللازمة لتحليل وتفسير النتائج بشكل صحيح التجريبية. يمكن أن تكون تكاليف هذه التقنيات المرتبطة في كثير من الأحيان يكون عائقا أمام القيام شاشات الجينوم واسعة. APCR / استنساخ النهج القائم ، في حين انها لم تكن بقوة ميكروأرس وتسلسل الجيل المقبل من هو بديل فعال وبتكلفة أقل.
اجيلنت يقدم الآن مجموعة والمخصص اعتمادا على مكتبة shRNA TRC لتقديم المزيد من المساعدات في شاشات LentiPlex. هذه الخيارات تسمح للباحثين استخدام LentiPlex لدراسة مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المهمة هي علامة تجارية مسجلة لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ
LentiPlex هي علامة تجارية لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog Number |
| LentiPlex Pooled Array | Sigma-Aldrich | SHPH01 |
| A549 Cells | ATCC | CCL-185 |
| TRAIL | Sigma-Aldrich | T5694 |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 |
| Topo TA Cloning Kit | Invitrogen | K4575-01 |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893 |
| GenElute Plasmid Miniprep kit | Sigma-Aldrich | PLN70 |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101 |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | H9268 |
Referenzen
- Rao, D. siRNA vs. shRNA: similarities and differences. Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).
- Root, D. Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library. Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).
- Fan, Q. Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).
- Ji, D. A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity. Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).
- Fillmore, C. Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).
- Bhardwaj, A. Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications. Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).
- Cheng, J. AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).
- Fernandez, A. Akt1 and Akt2: differentiating the aktion. Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).
- Luo, J. A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene. Cell. 137 (5), 835-835 (2009).
- Ketela, T. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).
