En compartmentalizing mikroflödessystem enhet för att utreda cancer migrering stamceller beskrivs. Denna nya plattform skapar en livskraftig cellulär mikromiljö och möjliggör mikroskopisk visualisering av levande celler förflyttning. Mycket rörliga cancerceller isoleras för att studera molekylära mekanismer för aggressiv infiltration, vilket kan leda till mer effektiv framtida behandlingar.
Under de senaste 40 åren investerat i USA över 200 miljarder dollar på cancerforskning, vilket resulterar i endast en 5% minskning av dödligheten. Ett stort hinder för att förbättra behandlingsresultaten är dåliga förståelsen av mekanismerna bakom cellulär migrering i samband med aggressiv cancer cell invasion, metastasering och terapeutisk motstånd 1. Glioblastoma multiforme (GBM), den vanligaste primära maligna vuxen hjärntumör 2, exemplifierar denna svårighet. Trots vanlig kirurgi, strålning och kemoterapi, är patienten medianöverlevnad endast femton månader, beroende på aggressiv GBM infiltration i intilliggande hjärnan och snabb cancer återkommer 2. Samspelet mellan avvikande cell vandrande mekanismer och tumören mikromiljön skilja sannolikt cancer från normala celler 3. Därför förbättrar terapeutiska metoder för GBM kräver en bättre förståelse av migration cancercellinjer mekanismer. Senaste arbete tyder THAta små subpopulation av celler i GBM, kan hjärntumör stamceller (BTSC) ansvara för terapeutisk motstånd och återfall. Mekanismerna bakom BTSC vandrande kapacitet först nu börjar att präglas 1,4.
På grund av en begränsning i visuell inspektion och geometriska manipulation, konventionella analyser migration 5 är begränsade till kvantifiera totala cellpopulationer. Däremot mikrofluidikanordningar tillåter en enda cell analys på grund av kompatibilitet med moderna mikroskopi och kontroll över mikromiljö 6-9.
Vi presenterar en metod för detaljerad karakterisering av BTSC migrering med compartmentalizing mikroflödessystem enheter. Dessa PDMS-tillverkade enheter kastar miljön vävnadsodling i tre anslutna fack: sådd kammare, mottagningskammare och överbrygga mikrokanaler. Vi skräddarsydda anordningen så att båda kamrarna har tillräckliga medier för att stödja livskraftig BTSC i 4-5 days utan media utbyte. Mycket rörliga BTSCs ursprungligen införts i sådd kammaren isoleras efter migreringen men överbrygga mikrokanaler till den parallella mottagningskammaren. Denna migrering simulerar cancer cellulära sprids genom mellanrummen i hjärnan. Fas levande bilder av cellmorfologi under migrering registreras under flera dagar. Långvandrande BTSC kan därför vara isolerade, återodlades och analyseras vidare.
Compartmentalizing mikrofluidik kan vara en mångsidig plattform för att studera flyttande beteende BTSCs och andra cancer stamceller. Genom att kombinera lutning generatorer, flödeshantering, mikro-elektroder och andra mikroflödessystem moduler, kan dessa enheter också användas för läkemedel screening och sjukdomsdiagnos 6. Isolering av en aggressiv subpopulation av flyttande celler kommer att möjliggöra studier av underliggande molekylära mekanismer.
Den mikroflödessystem enhet och bildregistreringskvalitet teknik som presenteras här ger en visuell karakterisering av cellulär morfologi under flyttningen. Jämfört med befintliga konventionella metoder, har mikroflödessystem plattformen fördelar kostnadseffektivitet, hög genomströmning och design flexibilitet. Den presenterade mikroskopiska visualisering system möjliggör studier och registrering av långsiktiga live cellmigration. Linsen-motoriserade funktionen gör det möjligt att spåra flera migration vägar i en hög bild-upplösning utan att störa provet.
Under montering av anordningen, är PDMS stämpel icke-permanent bunden till täckglas för att underlätta för PDL beläggning (steg 3,4). Det är viktigt att uppnå en god tätning för framgången av detta protokoll. Kontaminering införes från anordningens tillverkning, såsom luftbubbla i stämpel eller damm / skräp på substratet, kan äventyra bindningen och resultera i vätska läcker. Därför, TREATIng anordningen i en dammfri sätt är viktig för att förhindra fel på anordningen. Före PDL-beläggningen, de täckglas är salpetersyra behandlas och PDL lösningen centrifugeras för att eliminera damm / skräp. Vi finner tejp, alkohol skölj och vattenbad till stor hjälp i att ta bort damm / skräp från PDMS stämpeln om ett rent rum är inte tillgänglig. Efter PDMS stämpel i kontakt med täckglas, trycka på stämpeln försiktigt med pincett underlättar tätningen.
BTSCs kan berikas av prover från människa operationssalen genom sfär kultur i stamceller medium liknande kultur av normala neurala stamceller 10. BTSCs berikade på detta sätt visa stamceller-liknande egenskaper, såsom uttryck av markörer stamceller (CD133, nestin), differentiering till flera neurala linjer (gliaceller och neuronala) och tumör initiering i en orthotopic immunodeficient musmodell med så få som 100 celler 18. Även viss debatt finns om reningning och underhåll av BTSCs 1, 19-21, sfär odlade BTSCs upprätthålla bättre fenotyp och genotyp av föräldrarnas tumören 22-24.
Den fack utrymme efterliknar fysiologiska miljön för cellmigration. I vår enhet, BTSC uppvisar en stark kapacitet av migration genom en storlek begränsad yta genom att reglera cellulär morfologi. Vår karakterisering av cellen morfologiska förändringar indikerar Mode-transformationer i sex steg sekvens som kan modellera en eventuell ny detaljerad beskrivning av BTSC invasion av intilliggande hjärna. I tidiga stadier, cellerna får en betydande mängd av polaritet och generera adhesiva utsprång att effektivt förankra sig inuti mikrokanalen. När cellen beläggning i mikrokanalen är etablerad, omvandlar den till en cruising läge och upprätthåller detta läge för hela resan genom en mikrokanal. I detta skede BTSC hålla en hög motilitet och konsekvent riktning men spara energi. Iterestingly, verkar det som en mikrokanalen är begränsad till en cruising cell i taget, så att när en enda cell vidare till detta stadium, andra celler reträtt från mikrokanalen. Denna mekanism säkerställer troliga effektiviteten av tumör spridning och förhindrar överkonsumtion av näringsämnen i mikrokanalen. Efter avslutad migration över mikrokanalen, återfår en cell dess benägenhet för Vävstolar utskott och ytterligare prospektering efter invasionen mål eller nya vägar migration. Den compartmentalizing mikroflödessystem enheten erbjuder en ny in vitro innebär att skapa en mikromiljö för att studera BTSC infiltration av hjärnparenkymet.
Denna metod kan lätt anpassas till studiet av cancer stamceller (CSC) och flyttande cellinjer härledda från andra tumörtyper. Odling av celler i mikrofluidanordningen kan utföras i alla moderna biologin laboratorium som är utrustad med en inkubator och vävnadsodling expertis. Utrustad med en SU-8 master, PDMSgjutning och anordningsenheten är möjliga med några grundläggande utbildning i mjuk litografi. Dessutom kan denna plattform även förlängas för andra applikationer med att integrera andra funktionella moduler såsom lutning mixer, yta mönstring, flytande kontroll och mikroelektrod.
The authors have nothing to disclose.
PAC är delvis stöds av ett NIH T32 bidrag till University of Wisconsin Stem Cell träningsprogram (PA Clark). JSK delvis stöds av HEADRUSH hjärntumör Research professur, Roger Loff Memorial GBM Research Fund och UW stiftelsen / neurokirurgi hjärntumör Forskning och utbildning fonden. JCW och YH stöds delvis av NIH bidrag NIBIB 1R01EB009103-01.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose | Gibco / Invitrogen | 11965 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Ham’s F12 | Gibco / Invitrogen | 31765 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
B27 supplement minus vitamin A | Gibco / Invitrogen | 12587-010 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Antibiotic-Antimycotic (PSA) | Gibco / Invitrogen | 15240 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0313 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0021 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa | Sigma | H1027-250KU | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Laminin (natural mouse) | Gibco / Invitrogen | 23017-015 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Accutase | Millipore | SCR005 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Stem cell medium |
|
||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin |
|
||
Epidermal Growth Factor (EGF) |
|
||
Heparin |
|
||
su-8 photoresist | MicroChem | ||
Silicon handle wafer | WRS Materials | 3P01-5SSP-INV | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
laminin | BD Bioscience | 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration | |
Biostation IM | Nikon instruments |